rAAV-Vektoren können humane Knochenmarkaspirate in dynamischer und statischer Kultur stabil genetisch modifizieren
Venkatesan JK, Rey Rico A, Schmitt G, Kohn DM, Madry H, Cucchiarini M
Fragestellung: Knochenmarkaspirate können genetisch verändert werden und als Plattformen die Knorpelreparatur verbessern. Wir haben die Hypothese überprüft, dass rAAV-Vektoren humane Knochenmarkaspirate modifizieren können, um optimale Bedingungen für die Chondrogenese zu etablieren.
Methodik: Alle Transgene standen unter Kontrolle des CMV-IE Promotor/Enhancers: Beta-Galaktosidase ( β-gal) von E. coli (rAAV-lacZ), rot-fluoreszierendes-Protein Gen (RFP) von Discosoma sp. (rAAV-RPP) und Luciferase (luc) von Firefly (rAAV-luc). Knochenmarkaspirate wurden von Spendern, die sich einer Kniearthroplastik unterzogen hatten, gewonnen. Die Aspirate wurden in Kulturmedium gegeben und mit Vektoren transduziert. Die Proben wurden in statischer Kultur bzw. in dynamischen Rotationsbioreaktoren in definiertem chondrogenem Medium (bis zu 21 Tage) kultiviert. Transgenexpression wurde mittels X-Gal-Färbung, live Fluoreszenzmikroskopie und Luciferase-Aktivität bestimmt. Die transduktionseffiziens wurde mittels Paraffinschnitten histomorphometrisch bestimmt. Jede Kondition (N=3) wurde in drei unabhängigen Experimenten überprüft. Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt.
Ergebnisse: Es gab keine sichtbaren Unterschiede zwischen den transduzierten und nichttransduzierten Aspiraten, weder im statischen noch im dynamischem System. Eine anhaltende, effiziente Transgenexpression (RFP, lacZ) wurde in den Aspiraten in der statischen wie auch in der dynamischen Kultur für einen Zeitraum von bis zu 21 Tagen beobachtet verglichen mit Kontrollkonditionen. Die beiden Systeme zeigten keine sichtbaren Unterschiede. Die Transduktionseffizienz am Tag 21 in diesen Systemen lag bei ~80–85% (versus <2% in den Kontrollen). Die Zelldichte nahm in der dynamischen Kultur im Vergleich zur statischen Kultur signifikant zu (8.072 ±105 versus 5.004 ±97 Zellen/mm2, P ≤ 0.001). Es wurde durch die luc-Transduktion eine stabile und effiziente Luciferaseaktivität in der statischen bzw. dynamischen Kultur verglichen mit der Kontrollebehandlung erreicht (26,3 ±0,2 versus 9,8 ±0,1 RLU/µg Gesamtprotein in statischer Kultur und 30,6 ±0,1 versus 9,9 ±0,1 RLU/µg Gesamtprotein in dynamischer Kultur am Tag 21, also ein bis zu 3.1-facher Unterschied, P≤0.001).
Schlussfolgerungen: rAAV Vektoren können über einen längeren Zeitraum humane Knochenmarkaspirate modifizieren und dabei hohe und stabile Transgenexpressionsraten in statischen wie auch in dynamischen Kulturbedingungen und in Rotationsbioreaktoren, in denen die Zelldichte sich erhöht, erreichen. Diese Ergebnisse suggerieren, dass die genetische Modifikation von Knochenmarkaspiraten via rAAV wertvoll ist, um geeignete, dauerhafte Behandlungen für Knorpelläsionen zu entwickeln.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR15-579
doi: 10.3205/14dkou505, urn:nbn:de:0183-14dkou5054
Published: October 13, 2014
© 2014 Venkatesan et al.
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