by G. H. | Aug 19, 2019 | Chirurgische Orthopädie, News
Steigerung der osteogenen Differenzierung und zellulären Verträglichkeit nach Zugabe von 3-Phasen-Kompositmaterialien in vitro durch Applikation von neurogenen Pharmaka
Böttner P, Hartmann S, Schleicher I, Heinemann S, Kruppke B, Hanke T, Schnettler R, Lips KS
Fragestellung: Die zunehmende Inzidenz osteoporotischer Frakturen führt zu einer verstärkten Nachfrage an Ätiologie-adaptierten Osteosynthesematerialien für den Einsatz in der Orthopädie und Unfallchirurgie. In einer in vitro Untersuchung wird die stimulierende Wirkung von neurogenen Pharmaka auf die Verträglichkeit von Kompositen bestehend aus Silikat, Kollagen und einer Calciumphase untersucht.
Methodik: Als in vitro Systeme wurden humane mesenchymale Stammzellen (MSC) aus dem Bohrmehl von osteoporotischen und knochengesunden Spendern sowie eine Endothelzelllinie, welche ursprünglich aus dem Knochenmark stammt (HBMEC), verwendet. Die Zellen wurden mit granuliertem Xerogel-Komposit unter Zugabe von brain derived neurotrophic factor (BDNF), Acetylcholin (ACh), Nikotin, dem Parasympathomimetika Carbachol und dem Insektizid Chlorpyrifos inkubiert. Neben der lichtmikroskopischen Kontrolle wurde nach 1, 3 und 5 Tagen die Vitalität mittels MTT-Test bzw. nach 1, 14 und 21 Tagen die Zellzahl mittels Picogreen-Assay, die Differenzierung mittels Alkalischer Phosphatase Assay und der Calciumverbrauch im Medium bestimmt.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Die Vitalität der Endothelzellen nach Zugabe von zwei Xerogel-Granulaten mit unterschiedlicher Calciumphosphatphase zeigten keine signifikanten Unterschiede untereinander. Die Kontrolle ohne Zugabe von Material wies jedoch eine deutlich gesteigerte Vitalität im MTT-Test auf. Die lichtmikroskopische Evaluation wies eine Adhäsion der Endothelzellen an die Materialien nach. Durch die Applikation von Nikotin (10-6 M, p<0,000) und ACh (10-4 M, p<0,000) erfolgte eine Stimulation der Endothelzellen, während das Insektizid Chlorpyrifos einen negativen Einfluss aufwies (10-3 M, p<0,000).
Bei der Differenzierung von MSC zu aktiven Osteoblasten wurden die Zellen von osteoporotischen und knochengesunden Spenderinnen verglichen. Im ALP-Assay zeigte sich ein signifikanter Anstieg der Differenzierung der osteoporotischen Zellen im Vergleich zu den knochengesunden Zellen (p<0,000). Diese Steigerung war unabhängig von den eingesetzten Materialien und Pharmaka. Der Calciumverbrauch im Medium wies keine signifikante Regulation auf.
Die humanen osteoporotischen MSC wiesen eine überraschend gute Differenzierungskapazität auf, die weder durch die Xerogel-Granulate noch durch die Pharmaka beeinflusst wurde, sodass aufgrund unserer Ergebnisse vermutet werden kann, dass die untersuchten Ersatzmaterialien für eine weitere Evaluation in vivo in einem osteoporotischen Tiermodell geeignet sind.
Gefördert durch DFG (SFB/TRR 79)
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocPO11-315
doi: 10.3205/14dkou581, urn:nbn:de:0183-14dkou5811
Published: October 13, 2014
© 2014 Böttner et al.
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by G. H. | Aug 19, 2019 | Chirurgische Orthopädie, News
Testung der Biokompatibilität von Magnesium-substituierten Calcium-Phosphat Zementen
Kunisch E, Mänz S, Plöger F, Bossert J, Jandt K, Kinne RW
Fragestellung: Injizierbare Calcium-Phosphat Zemente (Ca-P) sind in der Orthopädie für die Versorgung von Knochendefekten weit verbreitet. Modifikationen der Zemente sollen ihre physikalischen und biomechanischen Eigenschaften verbessern. So kann über einen Zusatz von Magnesium die Degradation und die Injizierbarkeit der Ca-P Zemente beeinflusst werden. In der vorliegenden Studie wurde die Biokompatibilität von Magnesium-substituierten Ca-P Zementen mit der Osteoblasten-Indikatorzelllinie ATDC5 untersucht.
Methodik: Die Indikatorzelllinie ATDC5 wurde auf Ca-P Zement Plättchen mit unterschiedlichem Magnesiumgehalt ausgesät (0%, 1%, 2% und 3% Magnesium) und über einen Zeitraum von 10 Tagen kultiviert. Nach 1, 2, 3, 6, 8 und 10 Tagen Kultur wurde die Zellzahl mittels 4,6-Diamidin-2-Phenylindol (DAPI)-Färbung, die Vitalität mit Fluoresceindiacetat/Propidiumjodid-Färbung und die Aktivität der alkalischen Phosphatase über eine Umwandlung von p-Nitrophenylphosphat zu 4-Nitrophenol bestimmt.
Ergebnisse: Über einen Zeitraum von 10 Tagen wurde ein kontinuierlicher Anstieg der Zellzahl auf dem Kontrollzement (0% Magnesium) und den Magnesium-substituierten Zementen beobachtet, ohne signifikante Unterschiede zwischen Kontrollzement und den Magnesium-substituierten Zementen. Die Vitalität der Zellen auf dem Kontrollzement und den Magnesium-substituierten Zementen war über den gesamten Beobachtungszeitraum höher als 90%. Die Aktivität der alkalischen Phosphatase verminderte sich in den ersten 3 Tagen auf dem Kontrollzement und den Magnesium-substituierten Zementen. Am Tag 6, 8 und 10 konnte dann auf den Magnesium-substituierten Zementen eine leicht erhöhte Aktivität der alkalischen Phosphatase im Vergleich zu dem Kontrollzement beobachtet werden, allerdings erneut ohne signifikante Unterschiede.
Schlussfolgerung: Die Substitution von Ca-P Zementen mit Magnesium (bis zu 3%) hat keinen negativen Einfluss auf die Zellzahl oder die Vitalität der Osteoblasten-Indikatorzelllinie ATDC5. Die Magnesium-Substitution führte sogar zu einer numerischen Erhöhung der Aktivität der alkalischen Phosphatase. Somit zeigen Magnesium-substituierte Zemente eine gute Biokompatibilität mit perspektivischer Eignung für den in vivo Einsatz.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocPO11-1141
doi: 10.3205/14dkou580, urn:nbn:de:0183-14dkou5801
Published: October 13, 2014
© 2014 Kunisch et al.
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by G. H. | Aug 19, 2019 | Chirurgische Orthopädie, Konservative Orthopädie, News
Midkine-Defizienz verzögert die Chondrogenese während der frühen Phase der Frakturheilung
Haffner-Luntzer M, Heilmann A, Rapp A, Schinke T, Amling M, Ignatius A, Liedert A
Fragestellung: Ein potenziell wichtiger Wachstumsfaktor in der Frakturheilung ist Midkine (Mdk). Das Molekül wird in der frühen Phase der Frakturheilung in MSCs und Chondrozyten exprimiert (Ohta et al., 1999). Interessanterweise weisen Mdk-defiziente (Mdk-/-) Mäuse einen veränderten Knochen-Phänotyp auf, der sich durch eine erhöhte trabekuläre Knochenbildungsrate auszeichnet. Außerdem verringert Mdk-Defizienz eine Ovarektomie induzierte Osteoporose in Mäusen (Neunaber et al., 2010). Zusätzlich konnte in vivo ein negativer Einfluss von Mdk auf die mechanisch induzierte Knochenbildung und in vitro ein Einfluss von Mdk auf den Wnt-Signalweg in Osteoblasten nachgewiesen werden (Liedert et al., 2011). Aufgrund dieser Ergebnisse liegt die Vermutung nahe, dass Mdk eine wichtige Rolle in der Frakturheilung spielt. Das Ziel dieser Arbeit war es daher, die Frakturheilung in Mdk-/- Mäusen zu untersuchen.
Methodik: 18 weibliche Mdk-/- und 20 Wildtyp-Mäuse (C57BL/6) wurden für die Studie untersucht. Bei den Mäusen wurde eine standardisierte Femur-Osteotomie durchgeführt, die mittels eines externen Fixateurs stabilisiert wurde. Der Verlauf der Frakturheilung wurde 21 und 28 Tage post-op mittels Dreipunkt-Biegung, µCT und unentkalkter Histologie untersucht. 10 Tage post-op wurden histomorphometrische Daten anhand entkalkter histologischer Schnitte gewonnen. Die Ergebnisse wurden mittels Mann-Whitney-U Test hinsichtlich ihrer Signifikanz analysiert (p<0,05; n=6-7).
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Die histomorphometrische Auswertung der Frakturkalli ergab einen signifikant verringerten Knorpelanteil im Gesamtkallus Mdk-defizienter Mäuse 10 Tage post-op, 21 Tage post-op war der Knorpelanteil in diesen Tieren signifikant erhöht. Die frakturierten Femora der Mdk-/- Tiere wiesen 21 Tage post-op eine signifikant erniedrigte Biegesteifigkeit auf. Die µCT-Analyse ergab keine Unterschiede hinsichtlich der Knochenmineraldichte (BMD). Das Flächenträgheitsmoment (Ix) hingegen war in den Mdk-/- Tieren signifikant verringert. 28 Tage post-op ergab sich weder in der Biegesteifigkeit, noch in BMD und Ix ein Unterschied zwischen den Tiergruppen.
Mdk-defiziente Mäuse weisen eine verzögerte Chondrogenese im Verlauf der Frakturheilung auf. Da bereits nachgewiesen werden konnte, dass eine Mdk-überexprimierende chondrogene Zelllinie eine verstärkte Chondrogenese zeigt (Ohta et al., 1999), liegt die Vermutung nahe, dass Mdk eine wichtige Rolle bei der enchondralen Ossifikation während der frühen Phase der Frakturheilung spielt. Die verzögerte Chondrogenese in Mdk-/- Tieren könnte auch die Ursache für das verringerte Flächenträgheitsmoment und somit auch für die schlechtere Biegesteifigkeit der Femora 21 Tage post-op sein. 28 Tage post-op war die Frakturheilung in beiden Tiergruppen gleich weit fortgeschritten. Daraus schließen wir, dass die Frakturheilung durch Mdk-Defizienz zu einem frühen Zeitpunkt beeinflusst wird, aber die Mdk-Defizienz nicht zu einer Störung der späten Frakturheilung führt.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocSA33-712
doi: 10.3205/14dkou573, urn:nbn:de:0183-14dkou5731
Published: October 13, 2014
© 2014 Haffner-Luntzer et al.
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by G. H. | Aug 12, 2019 | Chirurgische Orthopädie, Konservative Orthopädie, News
Temperaturabhängige Variationen der Knochendichte in der Quantitativen Computertomographie (pQCT) beim biologischen Präparat
Busse D, Colcuc C, Busse AT, Steinhausen E, Gensior T, Martin W, Rixen D
Fragestellung: In vielen Studien konnte gezeigt werden, dass die Knochendichte ein wesentlicher Faktor für die biomechanische Stabilität ist. Somit stellt die Messung der Knochendichte eine wesentliche Säule bei der biomechanischen Untersuchung in/am biologischen Knochenmaterial dar. Die Messung der Knochendichte mittels der pQCT ist dabei ein etabliertes Verfahren.
Ziel der Studie war es die Veränderung der Knochendichte in Bezug auf die Temperatur des Präparates zu ermitteln.
Methodik: Als biologische Präparate dienten 20 Femura vom Schwein (3 Monate alte Tiere). Die Knochen wurden direkt nach der Schlachtung auf -24°C herunter gekühlt (Phase FROST1).
In diesem Zustand erfolgte dann die erste Knochendichtemessung. Gemessen wurden dabei die trabekuläre und die kortikale Dichte. Weiterhin wurde auf anatomische Variationen hin untersucht.
Nach erster Messung wurden alle Knochen über einen Zeitraum von 2 Tagen unter Raumtemperatur (20°C) aufgetaut (Phase TAU1). Unter Raumtemperatur erfolgte dann der zweite Messdurchgang.
Die Verifikation der Präparatemperatur erfolgte dabei mittels Infrarotmessung.
Das CT wurde dabei mit einer Schichtdicke von 0,75 mm gefahren.
Die Knochendichte wurde mit dem etablierten Verfahren der pQCT (Phantom + CT Fa. Siemens Somatom 16) bestimmt. Ermittelt wurden dabei Dichtewerte im physikalischen Sinne (mg Ca-HA/ml).
Als Messpunkt diente dabei jeweils der Femurkopf für die Knochendichte. Die Veränderungen der Abschwächung der Röntgenstrahlen wurden am Condylus med./lat. und an der Patella gemessen.
Alle Messungen wurden am Präparat jeweils dreimal durchgeführt und die Ergebnisse folgend gemittelt.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Anatomische Variationen wurden bei den untersuchten Schweinefemura nicht gefunden.
Als Mittelwerte(MW)/Median(MD) (angegeben in mg Ca-HA/ml). Beim ersten Gefrieren wurden Dichtewerte trabekulär von 340/329 und kortikal 430/418 gemessen. MW/MD nach dem ersten Auftauen ergaben trabekulär 334/320 und kortikal 405/396.
Die Standardabweichung (SD) für die trabekulären Werte war im gefrorenen Zustand 36,4 im getauten Zustand 36,3. Für die kortikalen Werte ergab sich im gefrorenen Zustand eine SD von 56,3 und getaut von 67,6.
Beim Vergleich der Knochendichte trabekulär gefroren versus trabekulär getaut ergab sich ein signifikanter Unterschied (p Wert <0,05). Beim Vergleich der Knochendichte kortikal getaut versus kortikal gefroren ergab sich zwar kein signifikanter Unterschied aber eine deutliche Tendenz (p Wert 0,07).
Es besteht für die trabekuläre Struktur im Schweinepräparat eine signifikante Variation der Knochendichte in Bezug auf die Temperatur (gefroren versus getaut). Die Knochendichte ist hier gefroren signifikant größer als getaut.
Bei der kortikalen Knochendichtemessung ist eine deutliche Tendenz zu erkennen, hier sollte zur weiteren Festigung die Gruppengröße erhöht werden.
Da die biomechanische Stabilität bei Testungen von Osteosynthesen wesentlich auch von der Knochendichte beeinflusst wird ist hier von einer Beeinflussung durch die Temperatur auszugehen.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocSA33-393
doi: 10.3205/14dkou578, urn:nbn:de:0183-14dkou5787
Published: October 13, 2014
© 2014 Busse et al.
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by G. H. | Aug 12, 2019 | Chirurgische Orthopädie, Konservative Orthopädie, News
Chondrogene Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen auf Kollagen I-Gelkonstrukten mittels Gentransfers von SOX-9, TGF-beta1 und BMP-2
Weißenberger M, Kunz M, Nöth U, Reboredo J, Rudert M, Steinert A
Fragestellung: Gentransfer stellt eine effiziente und elegante Verteilungsmethode dar, durch die chondrogene Faktoren an den Ort des Knorpeldefektes in vivo gebracht werden können. In Vorversuchen konnte bereits gezeigt werden, dass adenoviral-vermittelter Gentransfer von SOX-9, TGF-beta1 und BMP-2 die Chondrogenese in Aggregaten von primären mesenchymalen Stammzellen (MSZ) in vitro und in vivo induzieren kann. Diese Studie untersucht daher die Wirkung der adenoviral übertragenen Faktoren SOX-9, TGF-beta1 und BMP-2 auf die chondrogene Differenzierung von MSZ auf Kollagen I-Gelkonstrukten.
Methodik: Humane, adulte MSZ aus dem Knochenmark wurden nach adhärenter Kultur mit den durch Cre/loxP-Rekombination hergestellten, adenoviralen Vektoren für GFP, SOX-9, TGF-beta1 und BMP-2 mit einer MOI (multiplicity of infection) von 50 transduziert und für 3 Wochen auf Kollagen I-Hydrogelen und in chondrogenem Differenzierungsmedium (ITS/Dexamethason/Ascorbat) kultiviert. Nicht-transduzierte und GFP-transduzierte Kulturen dienten als Kontrolle. Die Auswertung der Transgenexpression über den Zeitverlauf erfolgte für die Transgene GFP und SOX-9 mittels Fluoreszenzmikroskopie, für TGF-beta1 und BMP-2 mittels ELISA. An Tag 21 wurden die Chondrogenese- und Hypertrophiestadien der Gelkonstrukte durch (immun-)histologische Färbungen sowie quantitative RT-PCR und über den Zeitverlauf quantitativ biochemisch untersucht.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Es konnte durch diese in-vitro-Arbeit gezeigt werden, dass MSZ auf Kollagen I-Gelen durch die Transgene SOX-9, TGF-beta1 und BMP-2 chondrogen differenziert werden können, was qualitativ in der Alcianblau- und Kollagen II-Färbung und quantitativ in der signifikant gesteigerten Synthese von Glykosaminoglykanen (GAG) im GAG-Assay ersichtlich wurde. Diese Ergebnisse konnten auch auf molekularbiologischer Ebene durch eine signifikante Hochregulation knorpelspezifischer Markergene in quantitativen RT-PCR-Analysen (Kollagen II, SOX-9) bestätigt werden. Die Kontrollgruppen waren in diesem System stets nicht chondrogen. Dabei zeigten die mit TGF-beta1 und BMP-2 transduzierten Gelkonstrukte mehr hypertrophe Merkmale im Vergleich zur SOX-9-Gruppe, sowohl in den biochemischen Untersuchungen (Alkalische Phosphatase) und immunhistochemischen Färbungen (Alkalische Phosphatase, Kollagen X) als auch in den quantitativen RT-PCR-Analysen (Alkalische Phosphatase, Kollagen X). Durch Gentransfer von SOX-9, TGF-beta1 und BMP-2 konnten MSZ auf Kollagen I-Gelen erfolgreich chondrogen differenziert werden. Somit könnten in Zukunft genetisch modifizierte Kollagen I-Hydrogele bei der Erzeugung von langzeitstabilem, hyalinem Knorpelgewebe in vivo als eine effektive Methode für die Knorpelregeneration angewandt werden.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocSA33-199
doi: 10.3205/14dkou576, urn:nbn:de:0183-14dkou5766
Published: October 13, 2014
© 2014 Weißenberger et al.
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Neutrophile Granulozyten bei der Frakturheilung: Freund oder Feind?
Kovtun A, Baur S, Wiegner R, Huber-Lang MS, Ignatius A
Fragestellung: Die Frakturheilung beginnt mit einer inflammatorischen Phase, die durch die Freisetzung von pro- und anti-inflammatorischen Mediatoren und die Rekrutierung von Immunzellen charakterisiert ist (Claes et al. 2012). Neutrophile Granulozyten gehören zu den ersten Zellen, die nach der Fraktur das Hämatom invadieren und hier „the first line of defence“ repräsentieren. Allerdings wurde die Rolle von Neutrophilen bei der Frakturheilung bisher kaum untersucht. Bisher existieren nur wenige experimentelle Studien im Rattenmodell. Diese Arbeiten postulierten einen negativen Einfluss neutrophiler Granulozyten auf die Knochenbildung, da ihre Depletion zu einer Verbesserung der Frakturheilung führte (Grøgaard et al. 1990, Chung et al. 2006). Eine Limitation dieser Arbeiten war jedoch die Applikation eines unspezifischen Antiserums zu Neutrophilendepletion, das weitere unspezifische Wirkungen haben dürfte. Ziel unserer Arbeit war es daher, die Rolle von Neutrophilen bei der Frakturheilung spezifischer zu analysieren.
Methodik: Wir führten Frakturheilungsstudien in einem Mausmodell mit spezifischer Neutrophilendepletion durch. Die Depletion neutrophiler Granulozyten wurde in C57BL/6J Mäusen (12 Wo alt, männlich) mit Hilfe eines spezifischen anti-Neutrophilen Antikörpers durchgeführt (anti-Ly-6G-Antikörper, Klon 1A8, BioLegend). 24 h nach der Injektion des Antikörpers erhielten die Mäuse eine Osteotomie des rechten Femurs, die mittels Fixateur Externe stabilisiert wurde. Nach einer Heilungszeit von 21 Tagen wurden die Frakturkalli biomechanisch, mikro-computertomographisch (µCT), histomorphometrisch und immunhistologisch untersucht. 24 Stunden nach Fraktur wurde Serum gewonnen und die Konzentration des Anaphylatoxins C5a mittels ELISA untersucht. Statistik: Student T-Test, Signifikanzniveau p<0.05.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Die Depletion führte zu einer signifikanten Erniedrigung von peripheren (ca. -80% bis Tag 7 nach Osteotomie) und lokalen (-62% 24h nach Osteotomie) Neutrophilen. Anti-Ly-6G-Antikörper-behandelte Tiere zeigten eine signifikant schlechtere Biegesteifigkeit des Femurs 21 Tage nach Osteotomie (-19%). Außerdem zeigte die histomorphometrische Untersuchung eine verringerte Knochenbildung im Frakturkallus von diesen Mäusen (-55%), was auch durch µCT-Daten bestätigt wurde. Die Konzentration von C5a im Serum war nach Antikörper-Behandlung unverändert.
Im Gegensatz zur bisher existierenden Literatur, die eine negativen Wirkung neutrophiler Granulozyten bei der Frakturheilung postulierte (Grøgaard et al. 1990, Chung et al. 2006), zeigen unsere Ergebnisse, dass die Invasion und Aktivierung von Neutrophilen in das Frakturhämatom für die reguläre Frakturheilung wichtig sein dürfte, da ihre spezifische Depletion die Frakturheilung signifikant verschlechterte. Unsere derzeitigen Arbeiten beschäftigen sich mit den zugrunde liegenden molekularen Mechanismen und der Rolle von Neutrophilen bei der durch ein schweres Trauma gestörten Frakturheilung.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocSA33-812
doi: 10.3205/14dkou572, urn:nbn:de:0183-14dkou5721
Published: October 13, 2014
© 2014 Kovtun et al.
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