by R-Dorotka | Apr 15, 2019 | Chirurgische Orthopädie, Konservative Orthopädie, News
BMP-2 Release aus mikroporösen beta-TCP Scaffolds mit Alginat als Carrier
Kißling S, Seidenstuecker M, Mayr HO, Südkamp NP, Bernstein A
Fragestellung: Bone Morphogenetic Protein-2 (BMP-2) führt zu gesteigerter Knochenneubildung. Die osteoinduktive Potenz von BMP-2 ist höher, wenn es in einen Träger eingebaut ist. Beta Tricalciumphosphat (beta-TCP) hat sich als geeignetes Material hinsichtlich Bioabbaubarkeit und mechanischer Stabilität erwiesen. Es ist bisher nicht gelungen, eine kontrollierte Freisetzungskinetik von BMP aus TCP-Scaffolds zu erzielen.
Das Ziel dieser Forschungsarbeit ist, eine definierte Freisetzung von BMP-2 über einen längeren Zeitraum durch Koppelung an ein Hydrogel zu erreichen und somit die Entwicklung eines osteoinduktiven, mechanisch stabilen Scaffolds.
Methodik: Als Modellsubstanz für BMP-2 wurde zunächst FITC-markiertes Protein A (2 mg/ml) verwendet. Für die Beladung der beta-TCP Zylinder (n=8; 40% Porosität, 5 μm Porendurchmesser, interkonnektierend, 7mm x 6 mm) wurden drei verschiedene Hydrogele verwendet und die Freisetzung miteinander verglichen: Gelatine, homogenes Alginatgel und inhomogen ausgehärtetes Alginat. Nach definierten Zeitpunkten (1, 2, 3, 6, 9, 14, 28 Tage) wurde freigesetzte Menge FITC-Protein A bestimmt. Anschließend wurde der Versuch mit dem inhomogen verfestigten Alginat und BMP-2 wiederholt. Weiter wurden beta-TCP-Scaffolds mit der Kombination BMP-2 (0,05 mg/ml) und Alginat (5% w/v) beladen und mit Osteoblast-like-cells (MG63) in Kontakt gebracht. Nach 24h, 48h und 96h wurde ein Live-Dead-Assay zur Beurteilung der Zellvitalität und der WST-1-Test zur Analyse der Viabilität durchgeführt.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Die Abgabe des FITC-Protein A erfolgte sowohl aus der Gelatine, als auch dem homogenen Alginat sehr schnell. So waren bereits nach 24h 80,9% aus der Gelatine und 76,1% aus dem homogenen Alginat freigesetzt.
Das Release aus dem inhomogenen Alginat betrug nach 24h lediglich 36% der Gesamtmenge. Das BMP-2-Release betrug am Tag 14 des Versuchs 257,33 ± 73,19 ng/ml (~11,1%) sowie an Tag 28 des Release-Versuchs 57,56 ± 18,78 ng/ml (~1,82%).
Nach dem Freisetzungsversuch wurden die Scaffolds aufgebrochen und mikroskopiert. Dabei zeigten sich nach 28 Tagen noch deutliche Überreste des FITC-Protein A.
Mit dem Live-Dead-Assay konnte nachgewiesen werden, dass die freigesetzte Menge BMP-2 nicht toxisch ist. Die Zellen wuchsen in das Alginat des beladenen Knochenersatzdübels hinein.
Der WST-1-Test zeigt einen signifikanten Unterschied der Zellviabilität bei Inkubation mit einem BMP-2 und Alginat beladenen Scaffold im Vergleich zu einem lediglich mit Alginat beladenen Scaffold. Dies belegt eine deutliche Proliferationssteigerung.Aufgrund der höheren physikalischen Löslichkeit ist bei dem homogenen Alginatgel und der Gelatine ein deutlicher Burstrelease zu verzeichnen. Das Release aus dem festeren inhomogenen Alginat ist deutlich konstanter.
Osteoblast-like-cells zeigten in Kombination mit den BMP-2 beladenen beta-TCP-Scaffolds eine signifikant erhöhte Proliferation, sowie gute Vitalität.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR18-1140
doi: 10.3205/14dkou527, urn:nbn:de:0183-14dkou5276
Published: October 13, 2014
© 2014 Kißling et al.
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/deed.en). You are free: to Share – to copy, distribute and transmit the work, provided the original author and source are credited.
by R-Dorotka | Apr 15, 2019 | Chirurgische Orthopädie, Konservative Orthopädie, News
Biomechanische Stimulation von Osteoblasten und mesenchymalen Stammzellen auf 3D-Nanostrukturen
Maheswaran V, Özdemir B, Plettl A, Brenner R, Fiedler J
Fragestellung: Der Einfluss nanoskaliger Strukturen auf die Osseointegration von Biomaterialien nimmt bei der Implantatentwicklung eine zentrale Rolle ein. In vorherigen Arbeiten konnten wir die Effekte verschiedener, starrer Nanostrukturen auf humane mesenchymale Stammzellen und Osteoblasten zeigen. Aufbauend auf diese Arbeiten haben wir die Untersuchung der Zell-Biomaterial-Wechselwirkung erweitert, indem ein neuartiges System zur biomechanischen Stimulation der Zellen auf SiO2 basierten dreidimensionalen Trägermaterialien etabliert wurde.
Methodik: Humane Osteoblasten (Ob) und mesenchymale Stammzellen (MSC) wurden aus Restgewebe von Total-Endoprothese-Operationen isoliert. Eine biomechanische Stimulation der Zellen auf 3D-Nanostrukturen erfolgte durch eine neuartige, selbstentwickelte Apparatur.
Mit dieser neuen Methode wurden biegeelastische nanolithotopographisch hergestellte dreidimensionale SiO2-Oberflächen (Abbildung 1 A [Abb. 1]) mit einer Höhe von 100 nm, einem Durchmesser von 10-30 nm und einem Säulenabstand von 100 nm mit Ob und MSC besiedelt und je für 30 min in 24 h zyklisch (Frequenz: 1 Hz) gebeugt. (Abbildung 1 B und C [Abb. 1]) Analysiert wurden die Genexpression osteogener und apoptotischer Markergene mittels quantitativer RT-PCR, sowie die Auswirkung der biomechanischen Stimulation auf das Zytoskelett über immunhistologische Färbungen von Aktin, Vinculin und Vimentin. Eine Statistische Auswertung erfolgte mittels Varianzanalyse (ANOVA).
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Die entwickelte Apparatur erlaubte die sterile Kultivierung der Zellen über den gesamten Testzeitraum von 48h. Im Vergleich zu den bisher untersuchten nanostrukturierten Substraten gab es bezüglich der Zelladhäsion keine Unterschiede, d.h. alle Zellen adhärierten auch auf den eingesetzten dreidimensionalen SiO2-Membranen. Nach der biomechanischen Stimulation zeigten die Zellen weiterhin Adhärenz auf dem Trägermaterial, wobei Zell-morphologische Unterschiede im Vergleich zu nicht stimulierten Oberflächen sichtbar wurden. Daraus ist zu Folgern, dass die geringen, im 1 nm Bereich liegenden Änderungen der Säulen-Abstände zur Modulation der Zell-Antwort führten. Dieser Einfluss konnte auch auf Genexpressionsebene nachgewiesen werden.
Somit erlaubt das entwickelte Gerät, in vitro strukturelle Änderungen einer 3D-Nanotopographie zu simulieren und deren zellbiologische Effekte zu analysieren. Dies bietet für die Zukunft völlig neue Möglichkeiten, das Zellverhalten auf nanoskaligen 3D-Strukturen unter biomechanischen Einflüssen zu testen.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR18-1108
doi: 10.3205/14dkou526, urn:nbn:de:0183-14dkou5268
Published: October 13, 2014
© 2014 Maheswaran et al.
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/deed.en). You are free: to Share – to copy, distribute and transmit the work, provided the original author and source are credited.
by R-Dorotka | Apr 8, 2019 | Chirurgische Orthopädie, Konservative Orthopädie
BMP-2 Release aus mikroporösen beta-TCP Scaffolds mit Alginat als Carrier
Kißling S, Seidenstuecker M, Mayr HO, Südkamp NP, Bernstein A
Fragestellung: Bone Morphogenetic Protein-2 (BMP-2) führt zu gesteigerter Knochenneubildung. Die osteoinduktive Potenz von BMP-2 ist höher, wenn es in einen Träger eingebaut ist. Beta Tricalciumphosphat (beta-TCP) hat sich als geeignetes Material hinsichtlich Bioabbaubarkeit und mechanischer Stabilität erwiesen. Es ist bisher nicht gelungen, eine kontrollierte Freisetzungskinetik von BMP aus TCP-Scaffolds zu erzielen.
Das Ziel dieser Forschungsarbeit ist, eine definierte Freisetzung von BMP-2 über einen längeren Zeitraum durch Koppelung an ein Hydrogel zu erreichen und somit die Entwicklung eines osteoinduktiven, mechanisch stabilen Scaffolds.
Methodik: Als Modellsubstanz für BMP-2 wurde zunächst FITC-markiertes Protein A (2 mg/ml) verwendet. Für die Beladung der beta-TCP Zylinder (n=8; 40% Porosität, 5 μm Porendurchmesser, interkonnektierend, 7mm x 6 mm) wurden drei verschiedene Hydrogele verwendet und die Freisetzung miteinander verglichen: Gelatine, homogenes Alginatgel und inhomogen ausgehärtetes Alginat. Nach definierten Zeitpunkten (1, 2, 3, 6, 9, 14, 28 Tage) wurde freigesetzte Menge FITC-Protein A bestimmt. Anschließend wurde der Versuch mit dem inhomogen verfestigten Alginat und BMP-2 wiederholt. Weiter wurden beta-TCP-Scaffolds mit der Kombination BMP-2 (0,05 mg/ml) und Alginat (5% w/v) beladen und mit Osteoblast-like-cells (MG63) in Kontakt gebracht. Nach 24h, 48h und 96h wurde ein Live-Dead-Assay zur Beurteilung der Zellvitalität und der WST-1-Test zur Analyse der Viabilität durchgeführt.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Die Abgabe des FITC-Protein A erfolgte sowohl aus der Gelatine, als auch dem homogenen Alginat sehr schnell. So waren bereits nach 24h 80,9% aus der Gelatine und 76,1% aus dem homogenen Alginat freigesetzt.
Das Release aus dem inhomogenen Alginat betrug nach 24h lediglich 36% der Gesamtmenge. Das BMP-2-Release betrug am Tag 14 des Versuchs 257,33 ± 73,19 ng/ml (~11,1%) sowie an Tag 28 des Release-Versuchs 57,56 ± 18,78 ng/ml (~1,82%).
Nach dem Freisetzungsversuch wurden die Scaffolds aufgebrochen und mikroskopiert. Dabei zeigten sich nach 28 Tagen noch deutliche Überreste des FITC-Protein A.
Mit dem Live-Dead-Assay konnte nachgewiesen werden, dass die freigesetzte Menge BMP-2 nicht toxisch ist. Die Zellen wuchsen in das Alginat des beladenen Knochenersatzdübels hinein.
Der WST-1-Test zeigt einen signifikanten Unterschied der Zellviabilität bei Inkubation mit einem BMP-2 und Alginat beladenen Scaffold im Vergleich zu einem lediglich mit Alginat beladenen Scaffold. Dies belegt eine deutliche Proliferationssteigerung.Aufgrund der höheren physikalischen Löslichkeit ist bei dem homogenen Alginatgel und der Gelatine ein deutlicher Burstrelease zu verzeichnen. Das Release aus dem festeren inhomogenen Alginat ist deutlich konstanter.
Osteoblast-like-cells zeigten in Kombination mit den BMP-2 beladenen beta-TCP-Scaffolds eine signifikant erhöhte Proliferation, sowie gute Vitalität.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR18-1140
doi: 10.3205/14dkou527, urn:nbn:de:0183-14dkou5276
Published: October 13, 2014
© 2014 Kißling et al.
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/deed.en). You are free: to Share – to copy, distribute and transmit the work, provided the original author and source are credited.
by R-Dorotka | Apr 8, 2019 | Chirurgische Orthopädie, Konservative Orthopädie
Biomechanische Stimulation von Osteoblasten und mesenchymalen Stammzellen auf 3D-Nanostrukturen
Maheswaran V, Özdemir B, Plettl A, Brenner R, Fiedler J
Fragestellung: Der Einfluss nanoskaliger Strukturen auf die Osseointegration von Biomaterialien nimmt bei der Implantatentwicklung eine zentrale Rolle ein. In vorherigen Arbeiten konnten wir die Effekte verschiedener, starrer Nanostrukturen auf humane mesenchymale Stammzellen und Osteoblasten zeigen. Aufbauend auf diese Arbeiten haben wir die Untersuchung der Zell-Biomaterial-Wechselwirkung erweitert, indem ein neuartiges System zur biomechanischen Stimulation der Zellen auf SiO2 basierten dreidimensionalen Trägermaterialien etabliert wurde.
Methodik: Humane Osteoblasten (Ob) und mesenchymale Stammzellen (MSC) wurden aus Restgewebe von Total-Endoprothese-Operationen isoliert. Eine biomechanische Stimulation der Zellen auf 3D-Nanostrukturen erfolgte durch eine neuartige, selbstentwickelte Apparatur.
Mit dieser neuen Methode wurden biegeelastische nanolithotopographisch hergestellte dreidimensionale SiO2-Oberflächen (Abbildung 1 A [Abb. 1]) mit einer Höhe von 100 nm, einem Durchmesser von 10-30 nm und einem Säulenabstand von 100 nm mit Ob und MSC besiedelt und je für 30 min in 24 h zyklisch (Frequenz: 1 Hz) gebeugt. (Abbildung 1 B und C [Abb. 1]) Analysiert wurden die Genexpression osteogener und apoptotischer Markergene mittels quantitativer RT-PCR, sowie die Auswirkung der biomechanischen Stimulation auf das Zytoskelett über immunhistologische Färbungen von Aktin, Vinculin und Vimentin. Eine Statistische Auswertung erfolgte mittels Varianzanalyse (ANOVA).
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Die entwickelte Apparatur erlaubte die sterile Kultivierung der Zellen über den gesamten Testzeitraum von 48h. Im Vergleich zu den bisher untersuchten nanostrukturierten Substraten gab es bezüglich der Zelladhäsion keine Unterschiede, d.h. alle Zellen adhärierten auch auf den eingesetzten dreidimensionalen SiO2-Membranen. Nach der biomechanischen Stimulation zeigten die Zellen weiterhin Adhärenz auf dem Trägermaterial, wobei Zell-morphologische Unterschiede im Vergleich zu nicht stimulierten Oberflächen sichtbar wurden. Daraus ist zu Folgern, dass die geringen, im 1 nm Bereich liegenden Änderungen der Säulen-Abstände zur Modulation der Zell-Antwort führten. Dieser Einfluss konnte auch auf Genexpressionsebene nachgewiesen werden.
Somit erlaubt das entwickelte Gerät, in vitro strukturelle Änderungen einer 3D-Nanotopographie zu simulieren und deren zellbiologische Effekte zu analysieren. Dies bietet für die Zukunft völlig neue Möglichkeiten, das Zellverhalten auf nanoskaligen 3D-Strukturen unter biomechanischen Einflüssen zu testen.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR18-1108
doi: 10.3205/14dkou526, urn:nbn:de:0183-14dkou5268
Published: October 13, 2014
© 2014 Maheswaran et al.
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/deed.en). You are free: to Share – to copy, distribute and transmit the work, provided the original author and source are credited.
by R-Dorotka | Apr 3, 2019 | Chirurgische Orthopädie, Konservative Orthopädie, News
Intracellular proliferation of S. aureus in osteoblasts and effects of rifampicin and gentamicin on S. aureus intracellular proliferation and survival
Mohamed W, Sommer U, Domann E, Schnettler R, Alt V
Objective: Staphylococcus aureus is the most frequent causal agent for bone infection. When S. aureus infection affects a total joint arthroplasty, removal and replacement of joint is mostly required. Moreover, it was recently discovered that S. aureus is able to invade osteoblasts thus escaping the extracellular host antibacterial defense and even antibiotics. This plays a significant role in persistence and recurrence of infection. The aim of this study was to investigate whether (1) S. aureus is able to not only invade but also proliferate within osteoblasts, (2) the mechanism of invasion and (3) to clarify whether rifampicin or gentamicin can inhibit intracellular proliferation and survival of S. aureus.
Method: SAOS-2 osteoblast-like cell line were grown in Minimum Essential Medium and subsequently infected with S. aureus EDCC5055 and S. aureus Rosenbach 1884 (ATCC 12598). In order to test the mode of bacterial internalization, SAOS-2 cells were treated 2h prior to infection with cytochalasin D which is the major actin depolymerization agent disrupting actin microfilaments. Immunofluorescence and transmission electromicroscopic (TEM) imaging were performed to detect potential intracellular and proliferating bacteria. For antibiotic experiments, SAOS-2 osteoblasts infected with S. aureus were treated with 7.5 microgram/ml of rifampicin or 30 microgram/ml, 100 microgram/ml, or 200 microgram/ml of gentamicin for 4h and 24h.
Results and conclusion: Both S. aureus strains were able to efficiently invade and to proliferate within human osteoblasts shown by typical bacterial growth curves. Immunofluorescence microscopy showed intracellular invasion of S. aureus and TEM images could demonstrate bacterial division as well as disruption of lysosomal membranes as a sign of successful intracellular proliferation and survival. Cytochalasin D was able to significantly reduce S. aureus invasion ability suggesting that invasion was enabled by promoting actin rearrangement at the cell surface. 7.5 microgram/ml of rifampicin was able to inhibit bacterial survival in human osteoblasts with almost complete elimination of bacteria after 4 h. Effects of gentamicin were dose-dependent but even high doses with 200 microgram/ml of gentamicin were associated with a statistically significant higher number of survived bacteria compared to rifampicin. In conclusion, S. aureus is not only able to invade but also to proliferate in osteoblasts. Invasion seems to be associated with actin rearrangement at the cell surface. Rifampicin is effective in intracellular eradication of S. aureus whereas gentamicin seems to have a much weaker intracellular effect. Based on these data, doses of rifampicin and gentamicin could be optimized for local use to coat end prostheses and be able to reach the intracellular compartments thus killing the probable intracellular persisting S. aureus without causing undesirable systemic side effects.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR17-1222
doi: 10.3205/14dkou524, urn:nbn:de:0183-14dkou5245
Published: October 13, 2014
© 2014 Mohamed et al.
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by R-Dorotka | Apr 3, 2019 | Chirurgische Orthopädie, Konservative Orthopädie, News
In-vitro Studie zur individuellen lokalen Freisetzung verschiedener Antibiotika gegen bakterielle Erreger einsatzbedingter Osteomyelitiden
Back DA, Calafi A, Bormann N, Garbe LA, Schmidmaier G, Willy C, Wildemann B
Fragestellung: Die häufigsten Verwundungen von Soldaten in Afghanistan betreffen das muskuloskeletale System. Zur Verhinderung von Osteomyelitiden ist ein chirurgisches Debridement mit additiver systemischer Antibiotikagabe das Mittel der ersten Wahl. Dieses Konzept könnte durch eine zusätzliche lokale Antibiotikafreisetzung von Implantaten ergänzt werden. Diese in-vitro Studie sollte die Möglichkeiten einer bestehenden Implantatbeschichtung erforschen, unterschiedliche Antibiotika einzeln oder in Mehrfachbeschichtung wirkungsvoll gegen einsatzrelevante Osteomyelitiserreger freizusetzen.
Methodik: Titan-Kirschner-Drähte wurden mit Poly(D,L-Laktid) (PDLLA) und verschiedenen Antibiotika (Abx)-Konzentrationen (3 pro Abx) Ciprofloxacin, Gentamicin, Colistin, Daptomycin und Cefoxitin beschichtet, bei 37°C in NaCl eluiert und nach 4 h, 1, 3, 7, 14, 28 und 42 Tagen Proben entnommen (n=6). Mit den Eluaten wurde eine Hemmhofbestimmung nach Kirby-Bauer gegen gram-positive (Staph. aureus, MRSA) oder gram-negative (Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa) Bakterienstämme durchgeführt. Die Abx-Konzentrationen in den effektivsten Elutionsreihen wurden mittels Massenspektrometrie oder KIMS-Verfahren quantifiziert. In einem weiteren Ansatz wurden Doppelbeschichtungen mit Gentamicin und Colistin (n=6) gegen eine simulierte Mischinfektion mit Staph. aureus und einem multiresistenten A. baumannii getestet. Um toxische Effekte auf Knochenzellen auszuschließen, wurden Osteoblasten mit den verschiedenen Konzentrationen der jeweiligen Abx kultiviert. Die metabolische Aktivität und die alkalische Phosphatase wurden nach 3 Tagen gemessen.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Als Beschichtungskonzentrationen mit den effektivsten bakterienhemmenden Eigenschaften wurden 10% w/w für Gentamicin, Colistin und Ciprofloxacin, sowie 40% w/w für Daptomycin identifiziert. Außer Daptomycin zeigten alle Abx einen initialen Burst-release mit kontinuierlicher Freisetzung über 42 Tage. Daptomycin wies eine gesteigerte Freisetzung innerhalb der ersten 24h auf. Cefoxitin führte in keiner Beschichtungs-Konzentration zu einem inhibitorischen mikrobiologischen Effekt und war auch in der Freisetzungskinetik nur gering nachweisbar. Die Doppelbeschichtung mit Gentamicin und Colistin führte zu einer effektiven Freisetzung beider Antibiotika mit nachweisbarer Bakterienhemmung. Keine der Konzentrationen zeigte einen inhibitorischen Effekt auf Osteoblasten in-vitro.
Diese Studie zeigt, dass die Möglichkeit besteht, mittels PDLLA Antibiotikabeschichtungen für Implantate herzustellen, die auch individuellen Keimspektren angepasst sind. Hierbei sind auch Doppel-Beschichtungen mit Antibiotika möglich. Bei den Implantatbeschichtungen ist das Mengenverhältnis eingearbeiteter Medikamente zu berücksichtigen, ferner bei der Freisetzungskinetik die Halbwertszeit der Antibiotika. Die Ergebnisse unterstützen eine weitere Erforschung der gewählten Beschichtungen zur Bekämpfung von Osteomyelitis-induzierenden einsatzrelevanten Bakterienstämmen.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR17-1440
doi: 10.3205/14dkou523, urn:nbn:de:0183-14dkou5231
Published: October 13, 2014
© 2014 Back et al.
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/deed.en). You are free: to Share – to copy, distribute and transmit the work, provided the original author and source are credited.
