by G. H. | Mrz 4, 2019 | Konservative Orthopädie, News
Autologe Tenozyten führen in Kombination mit einem resorbierbaren Kollagen-Scaffold zur verbesserten biomechanischen und histologischen Sehnenregeneration bei Rotatorenmanschettendefekten im Großtier
Roßbach BP, Pietschmann MF, Kempfert L, Ficklscherer A, Gülecyüz MF, Schmitt B, Ullamann T, Müller PE
Fragestellung: Die Regeneration von Rotatorenmanschettendefekten wird zum großen Teil durch die Gewebebiologie nach Rekonstruktion bestimmt. Hierbei führen unzureichende Vaskularisierung, Inflammation und Bildung von Ossifikationen zu Rerupturen und unbefriedigenden klinischen Ergebnissen. Eine neue Methode zur Sehnenregeneration stellt die Verwendung von autologen Tenozyten mit Scaffolds dar. Aufgrund der Größe sowie der Ähnlichkeit der Strukturen zur humanen Anatomie eignet sich hierbei das Großtiermodell am besten. Hypothese unserer Studie war, dass autologe Tenozyten in Kombination mit einem resorbierbaren Kollagen-Scaffold zu einer verbesserten biomechanischen und histologischen Sehnenregeneration von Rotatorenmanschettendefekten im Großtier führen.
Methodik: Nach Gewebebiopsie an der Patellasehne an acht Schafen, enzymatischer Verdauung und Kultivierung der Zellen in einer high-density Kultur wurden zehn Millionen autologe Tenozyten auf einem resorbierbaren Kollagen-Scaffold besiedelt und in einen critical-size-Defekt am Sehnen-Knochen-Übergang der rechten Infraspinatussehne dieser Tiere implantiert (Gruppe III). Als Vergleichsgruppen dienten jeweils acht Schafe mit Implantation eines unbesiedelten Scaffolds (Gruppe II) bzw. mit reiner Defektsetzung (Gruppe I). Die Euthanasie erfolgte 12 Wochen postoperativ und die gewonnenen Sehnenregenerate wurden biomechanisch und histologisch untersucht. Die kontralateralen Schultern dienten hierbei als Kontrollgruppe.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: In der biomechanischen Analyse wurde jedes Sehnenregenerat mit einer Vorlast von 10 N und einer Rate von 500 mm/min unter Dislokationskontrolle bis zum Versagen getestet. Bei gesunden Kontrollsehnen wurde eine durchschnittliche maximale Reißkraft von 2995 N ermittelt. Gruppe III mit besiedeltem Scaffold wies mit einem Durchschnittswert von 2516 N eine deutliche biomechanische Überlegenheit im Vergleich zu den Gruppen I mit Defektsetzung und II mit unbesiedeltem Scaffold mit 2004 N bzw. 2088 N auf. In der histologischen Aufbereitung konnte in Gruppe III im Gegensatz zu den beiden anderen Gruppen durch die Verwendung von autologen Tenozyten eine geringere Entzündungsreaktion, ein besser angeordneter Faserverlauf sowie eine vermehrte Kollagen- als auch Proteoglykan-Synthese im neuen Sehnenregenerat nachgewiesen werden.
Autologe Tenozyten führen in Kombination mit einem resorbierbaren Kollagen-Scaffold zur verbesserten biomechanischen und histologischen Sehnenregeneration gegenüber unbehandelten Defekten bzw. Defektauffüllung mit unbesiedeltem Scaffold bei Rotatorenmanschettendefekten im Großtier. Es könnte sich bei dieser Methode um einen vielversprechenden Ansatz zur Reparatur von nicht verschließbaren Sehnendefekten handeln.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR16-227
doi: 10.3205/14dkou511 , urn:nbn:de:0183-14dkou5111
Published: October 13, 2014
© 2014 Roßbach et al.
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by G. H. | Mrz 4, 2019 | Konservative Orthopädie, News
Regenerationsfähigkeit der irreversibel verfetteten Myozyten der Rotatorenmanschette nach Transplantation von allogenen mesenchymalen Stammzellen und Myozyten am Ratten-Modell – Erste Ergebnisse
Gülecyüz M, Eichmüller K, Pietschmann MF, Ficklscherer A, Roßbach BP, Niethammer TR, Müller PE
Fragestellung: Rotatorenmanschettenrupturen führen zu Funktionseinschränkungen und auf zellulärer Ebene zur irreversiblen Muskelverfettung. Im Tiermodell konnte nach RM-Naht keine spontane Regeneration der Verfettung beobachtet werden. Am Myocardischämie-Modell der Ratte konnte die lokale Applikation von mesenchymalen Stammzellen (MSC) die Regeneration der Kardiomyozyten fördern. Die Regenerationsfähigkeit der irreversiblen Skelettmuskelverfettung durch MSC wurde bis dato nicht untersucht. Diese Studie soll untersuchen ob eine fettige RM-Degeneration am Ratten-Modell mit lokaler Transplantation von allogenen Myozyten und MSC positiv zu beeinlussen ist.
Methodik: Nach Supraspinatussehnendurchtrennung wurde die Verfettung von Inzucht-Ratten über 4 bzw. 8 Wochen verursacht. Nach 4 Wochen wurden die Sehnenstümpfe von 64 Ratten (4 Gruppen à n= 6) transossär refixiert: die Kontrollgruppe wurde mit NaCl infiltriert; die Spontanheilungsgruppe wurde nach der Refixierung nicht behandelt; die MSC-Gruppe erhielt eine Infiltration von 5×10^6 allogenen MSC von Spendertieren; die Myozytengruppe erhielt eine Infiltration von 5×10^6 allogenen Myozyten von Spendertieren. Nach einer 4-wöchigen Heilungsphase (ings. 8 Wochen nach Defeksetzung) wurden die Ratten euthanasiert. Die Muskelmasse und Verfettung wurde mit zwei Vergleichsgruppen (Degeneration nach 4 bzw. 8 Wochen) und mit der nicht-behandelten Gegenseite quantitativ und histologisch verglichen.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Die mit MSC und Myozyten behandelten Gruppen zeigten eine signifikant höhere Muskelmasse im Vergleich zu der Defektgruppe nach 4 Wochen (Abb. 1). Eine Muskelmassenzunahme der MSC- und Myozyten-Gruppe im Vergleich zu der Defektgruppe nach 8 Wochen, Kontroll- oder Spontanheilungsgruppe konnte nicht beobachtet werden (Abb. 1). Die behandelten Gruppen zeigten im Vergleich zu der nicht-behandelten linken Seite (Tötung nach 4 Wochen) keinen signifikanten Unterschied (Abb. 3). Die nicht-behandelte linke Seite (Tötung nach 8 Wochen) zeigte aber eine signifikant höhere Muskelmasse im Vergleich zu den behandelten Gruppen (Abb. 4).
In diesem Defektmodell zeigt die Infiltration von allogenen Myozyten und MSC keine signifikante Überlegenheit im Vergleich zu der Kontroll- oder Spontanheilungsgruppe hinsichtlich der Muskelmassenzunahme. Dieses Phänomen lässt sich am ehesten durch den stark ausgeprägten Spontanheilungsprozess der Ratte erklären; wir beobachteten bei jedem Tier in jedem der behandelten Gruppen die Entwicklung eines Bindegewebestranges von der RM-Muskulatur zum Humeruskopf. Dieses Gewebe könnte die Funktion der abgesetzten Sehne als Neosehne übernommen und die vollständige Degeneration der Supraspinatussehne verhindert haben.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR16-946
doi: 10.3205/14dkou510 , urn:nbn:de:0183-14dkou5101
Published: October 13, 2014
© 2014 Gülecyüz et al.
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by G. H. | Feb 25, 2019 | Konservative Orthopädie, News
Der Einfluss von Glukose auf die Regeneration der Achillessehne im Rattenmodell
Korntner S, Kunkel N, Augat P, Resch H, Bauer HC, Traweger A, Tempfer H
Fragestellung: Diabetes und Übergewicht sind als Risikofaktoren für Sehnenrupturen, vermindertes Regenerationspotential und Tendinopathien beschrieben. Wir konnten zeigen, dass Sehnen von Menschen und Nagern Zellen enthalten, die Ähnlichkeit mit Betazellen des Pankreas aufweisen, wie z.B. Insulinsekretion infolge von Stimulation durch Glukose.
Ziel dieser Studie ist es, in einem Defektmodell der Achillessehne der Ratte zu untersuchen, ob die mit der Nahrung aufgenommene Glukosemenge einen Einfluss auf die Heilung der Sehne hat.
Methodik: Bei 60 weiblichen Lewis Ratten wurde 3mm proximal vom Calcaneus ein Totaldefekt der rechten Achillessehne generiert, der mit Ausnahme einer Hautnaht unversorgt blieb. In den folgenden 2 Wochen wurden die Tiere randomisiert 3 Diätgruppen zugeteilt. Neben der Kontrollgruppe, die Normalfutter (58% der Energie aus Stärke, 9% aus Fett und 33% aus Protein) bekam, wurde eine Gruppe mit Futter ernährt, das 67% der Energie aus Glukose, 27% aus Protein und 6% aus Fett liefert (Glukosegruppe), eine dritte Gruppe bekam Futter, welches Energie zu 94% aus Fett, 6% aus Protein und Kohlenhydraten liefert (Fettgruppe).
Unmittelbar vor, eine und zwei Wochen nach dem Eingriff wurde das Gangbild der Ratten untersucht (Noldus Catwalk XT). Nach zwei Wochen wurden die Ratten euthanasiert und neben dem Sehnendurchmesser wurde die Steifigkeit und Maximalkraft der Achillessehnen (n=14/Gruppe) bestimmt.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: 2 Wochen nach dem Eingriff zeigte sich kein signifikanter Unterschied im Körpergewicht der verschiedenen Gruppen und die Tiere waren nicht diabetisch.
Die regenerierten Sehnen der mit glukosereicher Nahrung gefütterten Tiere waren signifikant (p<0,05) steifer (19,13N/mm ±4.67) als jene der Kontrollgruppe (15,05N/mm±4.31) und jene der Fettgruppe (15,97±3,64). Die Steifigkeit dieser Sehnen war sogar vergleichbar mir jener der unverletzten Sehnen der Kontrollgruppe (20,91±7,44). Der Durchmesser der Sehne 3mm proximal vom Calcaneus war bei den Tieren der Glukosegruppe (3,6mm±0,3) und den Tieren der Fettgruppe (4,32mm±0,2) signifikant (p<0.05) höher als in der Kontrollgruppe (3,66mm±0,39).
Die Gangbildanalyse ergab, dass in der Glukosegruppe eine Woche nach dem Eingriff die Spreizung zwischen 2.und 4. Zehe signifikant (p<0.001) größer (0,53cm±0,08) war als in den beiden anderen Gruppen (Kontrollgruppe 0,47cm±0,08; Fettgruppe 0,41cm±0,06), was darauf hindeutet, dass die Tiere der Glukosegruppe die Extremität stärker belasten.
Wir zeigen mit dieser Arbeit erstmals, dass die über die Nahrung aufgenommene Zuckermenge Auswirkungen auf die funktionelle Regeneration von Sehnen nach einem Defekt hat.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR16-692
doi: 10.3205/14dkou509 , urn:nbn:de:0183-14dkou5096
Published: October 13, 2014
© 2014 Korntner et al.
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by G. H. | Feb 25, 2019 | Konservative Orthopädie, News
Molekulare Mechanismen der Sehnenalterung
Gehwolf R, Wagner A, Tempfer H, Lehner C, Bradshaw A, Bauer HC, Traweger A
Fragestellung: Molekulare und zelluläre Prozesse, die einer altersbedingten Verminderung der Sehnenqualität zugrunde liegen, sind weitestgehend unbekannt. In der vorgestellten Studie wurde anhand einer subtraktiven Suppressions-Hybridisierung (SSH) das Transkriptom von Achillessehnen junger adulter Mäuse (3 Monate – entspricht einem biologische Alter von 20-30 Jahren beim Menschen) mit jenem von alten Mäusen (18-20 Monate – entspricht einem biologische Alter von 56-70 Jahren beim Menschen) verglichen. Anhand der identifizierten, differentiell exprimierten Gene soll dann auf zelluläre Prozesse rückgeschlossen werden, die der Alterung von Sehnen zugrunde liegen und so möglicherweise therapeutische Ziele identifiziert werden.
Methodik: Für die subtraktive Suppressions-Hybridisierung wurde aus jeweils 10 jungen adulten und alten Mäusen die Achillessehnen präpariert und RNA isoliert. Die einzelnen RNA-Proben wurden gepoolt und daraus cDNA-Banken erstellt. Anschließend wurden mittels SSH differentiell exprimierte Gene identifiziert. Die entsprechenden cDNA-Klone wurden sequenziert und die differentielle Expression der identifizierten Gene mittels qRT-PCR verifiziert, sowohl im RNA-Pool als auch in den individuellen RNA-Proben.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Insgesamt wurden 90 cDNA Klone isoliert, die in den jungen und alten Sehnen differentiell exprimiert sind. Die Sequenzierung und anschließende Annotierung dieser Sequenzen zeigte, dass ein großer Teil für Proteine der extrazellulären Matrix kodiert, wie z.B. Kollagen Typ 1 und Typ 3, Decorin, Biglycan, Fibromodulin, Fibronectin, SPARC oder Thrombospondin 1. Außerdem konnten Proteasen der extrazellulären Matrix, wie z.B. MMP-2 und MMP-9 identifiziert werden. Auch das Kollagen-quervernetzende Enzym Lysyloxidase ist in den jungen und alten Achillessehnen unterschiedlich exprimiert. Die Transkription dieser Gene wurde mittels quantitativer RT-PCR verifiziert, mit dem Ergebnis, dass alle diese mRNAs in alten Sehnen signifikant niedriger exprimiert sind als in den jungen Sehnen. Zusätzlich zu den bereits erwähnten mRNAs zeigte auch Scleraxis, ein Marker für Sehnenvorläuferzellen in den alten Sehnen eine deutlich verminderte Expression.
Wir konnten Gene identifizieren, und diesen Genen Funktionen zuordnen, die möglicherweise an verschiedenen Prozessen der Sehnenseneszenz beteiligt sind. Dazu zählen u.a. die Kollagenremodellierung, der Auf-, Ab oder Umbau der extrazellulären Matrix oder die Kollagenprozessierung. Die Auswirkung dieser veränderten Genexpression wird z.Z. für ausgwählte Kandidaten weiterverfolgt, ebenso in vitro Experimente mit Sehnenzellen junger und alter Maus Achillessehnen.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR16-700
doi: 10.3205/14dkou508 , urn:nbn:de:0183-14dkou5086
Published: October 13, 2014
© 2014 Gehwolf et al.
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by G. H. | Feb 25, 2019 | Konservative Orthopädie, News
Tenozyten aus Supraspinatus-Sehnen mit starker Degeneration und von Rauchern zeigen ein Ungleichgewicht in der Expression von MMPs und TIMPs – eine Pilotstudie
Klatte-Schulz F, Pauly S, Gerhardt C, Scheibel M, Wildemann B
Fragestellung: Das Heilungsergebnis nach einer Rotatorenmanschetten-Rekonstruktion wird durch die klinischen Eigenschaften eines Patienten beeinflusst. Der molekular- oder zellbiologische Hintergrund dieses Zusammenhanges ist bisher weitgehend unbekannt. Es wird vermutet, dass Matrix Metalloproteinasen (MMPs) und deren Inhibitoren, die Tissue Inhibitors of Metalloproteinases (TIMPs), eine wichtige Rolle bei der Sehnenheilung spielen, indem sie das Modeling und Remodeling steuern. Ein Ungleichgewicht zwischen MMPs und TIMPs könnte die Heilung negativ beeinflussen. Das Ziel des Projektes war es einen möglichen Zusammenhang zwischen den Charakteristika der Patienten mit der MMP- und TIMP-Expression der Tenozyten herzustellen.
Methodik: Es wurden Tenozyten aus Supraspinatussehnen Biopsien von 18 männlichen Spendern verwendet. Die Expression folgender Gene wurde mittels Real-Time PCR untersucht: MMP-1, -3, -9, -13, TIMP-1, -2, -3 und -4. Für jeden Spender wurden die Parameter Alter, Nikotin-Konsum, Kortison-Gabe und der degenerative Status der Sehne (fettige Infiltration des SSP Muskels nach Goutallier, Sehnenretraktion nach Patte, Rupturgröße nach Bateman) erhoben. Zur statistischen Analyse wurde der Mann-Whitney-U Test und die Spearman’s Rho Korrelation angewendet. Für den Mann-Whitney-U Test wurde die fettige Infiltration, Sehnenretraktion und Rupturgröße in 2 Gruppen eingeteilt. (Goutallier: 0-1,5 und 2-4, Patte: 0-1,5 und 2-3, Bateman: 1-2,5 und 3-4).
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Der Grad der fettigen Infiltration des Muskels korrelierte mit dem Alter (p=0.026) und der Sehnenretraktion (p<0.001). Die Sehnenretraktion korrelierte mit der Rupturgröße (p=0,02). Bei 78% der Spender gab es eine Überlappung zwischen dem Nikotin-Konsum und der Kortison-Gabe. Die Tenozyten exprimierten alle TIMP Isoformen sowie MMP-1 und MMP-3. Nur 9 von 18 Spendern exprimierten MMP-9 und MMP-13. Die MMP-3 Expression korrelierte positiv mit der Expression von MMP-13 (p=0.017), TIMP-2 (p=0.009) und TIMP-4 (p<0.001). Die TIMP-2 Expression korrelierte positiv mit TIMP-1 (p=0.013) und TIMP-4 (p=0.016). Der Gruppenvergleich ergab, dass die TIMP-3 Expression signifikant verringert war in Zellen von Spendern mit hoher Sehnenretraktion (p=0,043) und fettiger Infiltration (p=0,027). Zusätzlich war die Expression von TIMP-2 in Zellen von Spendern mit hoher Sehnenretraktion herunter reguliert (p=0,027). Bei Rauchern wurde eine signifikant erhöhte MMP-1 Expression beobachtet gegenüber Nichtrauchern (p=0,009).
Ein Ungleichgewicht zwischen MMPs und TIMPs in Tenozyten von Rauchern und Spendern mit stärker degenerierten Sehnen könnten in vivo zu einer erhöhten Degradation der Sehnen-Matrix führen und damit in einem schlechteren Heilungspotential bei diesen Patientengruppen resultieren. Diese Pilotstudie beschreibt die Untersuchung der MMP und TIMP Expression in Zellen einer kleinen Patienten-Kohorte. Zukünftig sind weiterführenden Untersuchungen auf RNA- und Proteinebene vorgesehen, bei der mehr Spender eingeschlossen werden sollen.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR16-541
doi: 10.3205/14dkou507 , urn:nbn:de:0183-14dkou5076
Published: October 13, 2014
© 2014 Klatte-Schulz et al.
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by G. H. | Feb 19, 2019 | Konservative Orthopädie, News
rAAV-Vektoren können humane Knochenmarkaspirate in dynamischer und statischer Kultur stabil genetisch modifizieren
Venkatesan JK, Rey Rico A, Schmitt G, Kohn DM, Madry H, Cucchiarini M
Fragestellung: Knochenmarkaspirate können genetisch verändert werden und als Plattformen die Knorpelreparatur verbessern. Wir haben die Hypothese überprüft, dass rAAV-Vektoren humane Knochenmarkaspirate modifizieren können, um optimale Bedingungen für die Chondrogenese zu etablieren.
Methodik: Alle Transgene standen unter Kontrolle des CMV-IE Promotor/Enhancers: Beta-Galaktosidase ( β-gal) von E. coli (rAAV-lacZ), rot-fluoreszierendes-Protein Gen (RFP) von Discosoma sp. (rAAV-RPP) und Luciferase (luc) von Firefly (rAAV-luc). Knochenmarkaspirate wurden von Spendern, die sich einer Kniearthroplastik unterzogen hatten, gewonnen. Die Aspirate wurden in Kulturmedium gegeben und mit Vektoren transduziert. Die Proben wurden in statischer Kultur bzw. in dynamischen Rotationsbioreaktoren in definiertem chondrogenem Medium (bis zu 21 Tage) kultiviert. Transgenexpression wurde mittels X-Gal-Färbung, live Fluoreszenzmikroskopie und Luciferase-Aktivität bestimmt. Die transduktionseffiziens wurde mittels Paraffinschnitten histomorphometrisch bestimmt. Jede Kondition (N=3) wurde in drei unabhängigen Experimenten überprüft. Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt.
Ergebnisse: Es gab keine sichtbaren Unterschiede zwischen den transduzierten und nichttransduzierten Aspiraten, weder im statischen noch im dynamischem System. Eine anhaltende, effiziente Transgenexpression (RFP, lacZ) wurde in den Aspiraten in der statischen wie auch in der dynamischen Kultur für einen Zeitraum von bis zu 21 Tagen beobachtet verglichen mit Kontrollkonditionen. Die beiden Systeme zeigten keine sichtbaren Unterschiede. Die Transduktionseffizienz am Tag 21 in diesen Systemen lag bei ~80–85% (versus <2% in den Kontrollen). Die Zelldichte nahm in der dynamischen Kultur im Vergleich zur statischen Kultur signifikant zu (8.072 ±105 versus 5.004 ±97 Zellen/mm2, P ≤ 0.001). Es wurde durch die luc-Transduktion eine stabile und effiziente Luciferaseaktivität in der statischen bzw. dynamischen Kultur verglichen mit der Kontrollebehandlung erreicht (26,3 ±0,2 versus 9,8 ±0,1 RLU/µg Gesamtprotein in statischer Kultur und 30,6 ±0,1 versus 9,9 ±0,1 RLU/µg Gesamtprotein in dynamischer Kultur am Tag 21, also ein bis zu 3.1-facher Unterschied, P≤0.001).
Schlussfolgerungen: rAAV Vektoren können über einen längeren Zeitraum humane Knochenmarkaspirate modifizieren und dabei hohe und stabile Transgenexpressionsraten in statischen wie auch in dynamischen Kulturbedingungen und in Rotationsbioreaktoren, in denen die Zelldichte sich erhöht, erreichen. Diese Ergebnisse suggerieren, dass die genetische Modifikation von Knochenmarkaspiraten via rAAV wertvoll ist, um geeignete, dauerhafte Behandlungen für Knorpelläsionen zu entwickeln.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR15-579
doi: 10.3205/14dkou505, urn:nbn:de:0183-14dkou5054
Published: October 13, 2014
© 2014 Venkatesan et al.
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