by G. H. | Feb 19, 2019 | Konservative Orthopädie, News
TGF-β1-freisetzende Poly(Ether-Ester)-Multiblock-Scaffolds ermöglichen eine effiziente chondrogene Differenzierung von human mesenchymalen Stammzellen
Rey Rico A, Venkatasan JK, Sohier G, Moroni L, Madry H
Fragestellung: Die Verbesserung der Chondrogenese von mesenchymalen Stammzellen (hMSZs) ist ein Ziel zur Verbesserung der Knorpelreparatur. Der Wachstumsfaktor TGF-β ist ein kritischer Induktor der Chondrogenese. Jedoch limitiert seine kurze Halbwertzeit seinen klinischen Nutzen. Wir testeten die Eignung von mit TGF-β1 beschichteten porösen Scaffolds zur verzögerten Freisetzung von TGF-β1 und effizienten chondrogenen Differenzierung von hMSZ ohne zusätzliche Zugabe von TGF-β.
Methodik: Poly(Ether-Ester)-Multiblock-Scaffolds wurden mit TGF-β beschichtet. Anschließend wurden Zellaggregate von hMSZs über 21 Tage in chondrogenem Medium (ohne oder mit TGF-β) kultiviert: Pellets ohne Scaffold mit TGF-β1 (10 ng/ml) (Gruppe 1); Pellets mit unbeladenen Scaffolds mit TGF-β1 (Gruppe 2); Pellets mit TGF-β1-beladenen Scaffolds (TGF-β-Scaffolds), ohne TGF-β1 (Gruppe 3); Pellets mit unbeladenen Scaffolds ohne TGF-β1 (Gruppe 4). TGF-β1 wurde per ELISA quantifiziert, Pelletgröße digital bestimmt. Paraffinschnitte wurden mit Toluidinblau, H&E und Alizarinrot sowie per Typ-II- und -X-Kollagenimmunhistochemie gefärbt. Grad der Chondrogenese und hypertrophe Differenzierung wurde per Bewertungssystem, Glykosaminoglykan- (GAG) und DNS-Gehalt wurden biochemisch bestimmt, Genexpression per Realtime-RT-PCR analysiert. Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt (jede Kondition: 3 Pellets, n=3 Experimente).
Ergebnisse: Ergebnisse: TGF-β-Scaffolds setzten TGF-β1 kontrolliert für mindestens 21 Tage frei, mit einer Abgabe von ~10% innerhalb dieser Zeit. Während Pellets in Gruppe 4 zerfielen, waren die Durchschnittsgrößen der Pellets der übrigen Gruppen gleich (Gruppe 1: 1,02±0,06 mm; Gruppe 2: 1,02±0,06 mm; Gruppe 3: 1,00±0,04 mm)(P ≥ 0,3). Vergleichbare Muster der Chondrogenese zeigten sich bei Pellets mit TGF-β-Scaffolds (Gruppe 3) und den Gruppen 1 und 2 (Gesamtscore: 8,13±0,06; 8,79±0,29 und 9,13±0,18; jeweils Gruppen 1-3) versus 0,58±0,12 in der Abwesenheit von TGF-β1 (Gruppe 4). Der höchste GAG-Gehalt der Pellets (≥ 94% im Pellet, ≤ 6% sezerniert) wurde in allen mit TGF-β1 behandelten Pellets (Gruppen 1-3) nachgewiesen, im Vergleich mit Pellets der Negativkontrolle (~60% im Pellet, ~40% sezerniert; Gruppe 4). Keine hypertrophen Veränderungen fanden sich in den TGF-β1-behandelten Pellets (Gesamtswert: 2,25±0,12; 2,21±0,18 und 2,29±0,06; jeweils Gruppen 1-3) im Vergleich mit Kontrollpellets (4,96±0,41; Gruppe 4). TGF-β1-Scaffolds stimulierten eine ~200- bzw. 700-fache Erhöhung der Aggrecan- bzw. Typ-II-Kollagen-Expression verglichen mit der Zugabe von TGF-β1 zum Medium.
Schlussfolgerungen: TGF-β1-beladene Multiblock-Scaffolds geben kontrolliert bioaktives TGF-β1 ab. Sie erlauben die Chondrogenese von hMSZ ohne Zugabe von exogenem TGF-β1. Diese Scaffolds könnten klinisch zukünftig bei der Mikrofrakturierung fokaler Knorpeldefekte in die Perforationen des subchondralen Knochens implantiert werden, um die Knorpelreparatur zu verbessern.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR15-1056
doi: 10.3205/14dkou504, urn:nbn:de:0183-14dkou5049
Published: October 13, 2014
© 2014 Rey Rico et al.
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/deed.en). You are free: to Share – to copy, distribute and transmit the work, provided the original author and source are credited.
by G. H. | Feb 19, 2019 | Konservative Orthopädie, News
Simulation degenerativer und pro-inflammatorischer Bedingungen zur Testung der Zelltherapie im Bandscheiben-Organkultursystem
Neidlinger-Wilke C, Teixeira GPQ, Boldt A, Mollenhauer J, Wilke HJ, Barbosa MA, Ignatius A, Goncalves R
Fragestellung: Der Erfolg einer zelltherapeutischen Behandlung der Bandscheiben-degeneration erfordert die Überlebensfähigkeit und Aktivität injizierter Zellen in einer Umgebung, die durch geringe Nährstoffversorgung, niedrige Osmolarität und inflammatorische Bedingungen geprägt ist. Im bovinen Organkultursystem haben wir degenerative und inflammatorische Bedingungen simuliert und die Eignung dieses Ansatzes zur Testung des Schicksals injizierter Zellen unter diesen Bedingungen überprüft.
Methodik: Organkulturen aus bovinen Bandscheiben (je 5-6 Stück pro Präparat) wurden nach 6 Tagen Vorkultur mit einer Nadel punktiert und für 2 Tage mit inflammatorischen Faktoren behandelt (LPS, IL1β) bzw. als unbehandelte Kontrollen belassen. Die Induktion einer inflammatorischen Antwort wurde durch Prostaglandin-(PGE2)-Analyse der Medienüberstände und Expressionsanalyse der isolierten Zellen bezüglich inflammatorischer Zytokine, MMPs, Aggrecan und Kollagen Typ II (Koll-2) untersucht. Das Stoffwechselprofil der Organkulturen wurde über den Glucoseverbrauch bestimmt. Zur Simulation normaler oder degenerativer Bedingungen wurde das Kulturmedium auf Normalbedingungen (5mM Glucose, 400 mOsm) oder Nährstoffmangel (0,05 mM Glucose, 300 mOsm) eingestellt. Einem Teil der Bandscheiben wurden fluoreszenz-markierte Bandscheiben-Zellen (PKH-67/26) in einem Albumin-Hydrogel injiziert. Bandscheiben mit injizierten Zellen wurden nach 1, 2 und 4 Wochen Inkubationszeit histomorphologisch und immunhistochemisch analysiert und der Glycosaminoglycan-(GAG)-Gehalt wurde bestimmt.
Ergebnisse: Die PGE2-Konzentration wurde durch Behandlung der Organkulturen mit LPS (10 µg/mL) oder IL1β (10 ng/mL bzw. 100 ng/mL) im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen signifikant erhöht (jeweils 21.7±0.8-fach, 5.5±0.9-fach bzw. 9.6±0.8-fach, n=27, p<0.0001). Erste Ergebnisse zeigten in Zellen, die aus LPS- oder IL1β-behandelten Proben isoliert wurden, eine erhöhte Expression von IL-6, IL-8, MMP-1 and MMP-3 und eine Erniedrigung der Koll-II und Aggrecan-Expression. Der GAG-Gehalt der Proben nahm während 2 Wochen Kulturzeit deutlich ab (62,4 ± 9%). Bezüglich der Glucose-Verbrauchswerte und der Lactat-Produktion zeigten die behandelten Proben ähnliche Werte wie die Kontrollen und lagen oberhalb des kritischen Mangel-Grenzwertes (1mM). Fluoreszierende Zellen konnten zu jedem Zeitpunkt im Gewebe nachgewiesen werden, mit nur geringen Unterschieden zwischen den verschiedenen Kulturbedingungen.
Schlussfolgerung: Durch Simulation degenerativer oder inflammatorischer Umgebungsbedingungen konnten wir in Organkulturen eine PGE2-Erhöhung, eine Expressionserhöhung von MMPs und Interleukinen sowie eine erniedrigte Matrixprotein-Expression induzieren. Der Nachweis injizierter fluoreszenz-markierter Zellen ermöglicht die Charakterisierung der Zellreaktionen unter Simulation einer degenerativen Umgebung. Dieses Modell bietet vielversprechende Möglichkeiten zur In-vitro-Testung regenerativer und anti-inflammatorischer Therapien der Bandscheibendegeneration.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR15-721
doi: 10.3205/14dkou503, urn:nbn:de:0183-14dkou5031
Published: October 13, 2014
© 2014 Neidlinger-Wilke et al.
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/deed.en). You are free: to Share – to copy, distribute and transmit the work, provided the original author and source are credited.
by G. H. | Feb 13, 2019 | Knie + Endoprothetik, Konservative Orthopädie
Simulation degenerativer und pro-inflammatorischer Bedingungen zur Testung der Zelltherapie im Bandscheiben-Organkultursystem
Neidlinger-Wilke C, Teixeira GPQ, Boldt A, Mollenhauer J, Wilke HJ, Barbosa MA, Ignatius A, Goncalves R
Fragestellung: Der Erfolg einer zelltherapeutischen Behandlung der Bandscheiben-degeneration erfordert die Überlebensfähigkeit und Aktivität injizierter Zellen in einer Umgebung, die durch geringe Nährstoffversorgung, niedrige Osmolarität und inflammatorische Bedingungen geprägt ist. Im bovinen Organkultursystem haben wir degenerative und inflammatorische Bedingungen simuliert und die Eignung dieses Ansatzes zur Testung des Schicksals injizierter Zellen unter diesen Bedingungen überprüft.
Methodik: Organkulturen aus bovinen Bandscheiben (je 5-6 Stück pro Präparat) wurden nach 6 Tagen Vorkultur mit einer Nadel punktiert und für 2 Tage mit inflammatorischen Faktoren behandelt (LPS, IL1β) bzw. als unbehandelte Kontrollen belassen. Die Induktion einer inflammatorischen Antwort wurde durch Prostaglandin-(PGE2)-Analyse der Medienüberstände und Expressionsanalyse der isolierten Zellen bezüglich inflammatorischer Zytokine, MMPs, Aggrecan und Kollagen Typ II (Koll-2) untersucht. Das Stoffwechselprofil der Organkulturen wurde über den Glucoseverbrauch bestimmt. Zur Simulation normaler oder degenerativer Bedingungen wurde das Kulturmedium auf Normalbedingungen (5mM Glucose, 400 mOsm) oder Nährstoffmangel (0,05 mM Glucose, 300 mOsm) eingestellt. Einem Teil der Bandscheiben wurden fluoreszenz-markierte Bandscheiben-Zellen (PKH-67/26) in einem Albumin-Hydrogel injiziert. Bandscheiben mit injizierten Zellen wurden nach 1, 2 und 4 Wochen Inkubationszeit histomorphologisch und immunhistochemisch analysiert und der Glycosaminoglycan-(GAG)-Gehalt wurde bestimmt.
Ergebnisse: Die PGE2-Konzentration wurde durch Behandlung der Organkulturen mit LPS (10 µg/mL) oder IL1β (10 ng/mL bzw. 100 ng/mL) im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen signifikant erhöht (jeweils 21.7±0.8-fach, 5.5±0.9-fach bzw. 9.6±0.8-fach, n=27, p<0.0001). Erste Ergebnisse zeigten in Zellen, die aus LPS- oder IL1β-behandelten Proben isoliert wurden, eine erhöhte Expression von IL-6, IL-8, MMP-1 and MMP-3 und eine Erniedrigung der Koll-II und Aggrecan-Expression. Der GAG-Gehalt der Proben nahm während 2 Wochen Kulturzeit deutlich ab (62,4 ± 9%). Bezüglich der Glucose-Verbrauchswerte und der Lactat-Produktion zeigten die behandelten Proben ähnliche Werte wie die Kontrollen und lagen oberhalb des kritischen Mangel-Grenzwertes (1mM). Fluoreszierende Zellen konnten zu jedem Zeitpunkt im Gewebe nachgewiesen werden, mit nur geringen Unterschieden zwischen den verschiedenen Kulturbedingungen.
Schlussfolgerung: Durch Simulation degenerativer oder inflammatorischer Umgebungsbedingungen konnten wir in Organkulturen eine PGE2-Erhöhung, eine Expressionserhöhung von MMPs und Interleukinen sowie eine erniedrigte Matrixprotein-Expression induzieren. Der Nachweis injizierter fluoreszenz-markierter Zellen ermöglicht die Charakterisierung der Zellreaktionen unter Simulation einer degenerativen Umgebung. Dieses Modell bietet vielversprechende Möglichkeiten zur In-vitro-Testung regenerativer und anti-inflammatorischer Therapien der Bandscheibendegeneration.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR15-721
doi: 10.3205/14dkou503, urn:nbn:de:0183-14dkou5031
Published: October 13, 2014
© 2014 Neidlinger-Wilke et al.
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by G. H. | Feb 13, 2019 | Konservative Orthopädie, News
Ergebnisse einer tierexperimentellen Studie zur Behandlung großflächiger Knorpelschäden
Andereya S, Gavenis K, Schneider U
Fragestellung: Die vorliegende tierexperimentelle Studie soll Aufschlüsse darüber geben, ob eine zellbesiedelte komprimierte Kollagengelmatrix zur Behandlung großflächiger Knorpelschäden geeignet ist.
Methodik: Bei 18 Göttinger Minipigs wurden großflächige Knorpelschäden am Kniegelenk mit einer verdichteten dreidimensionalen zellbesiedelten Kollagengelmatrix behandelt und nach 6 Wochen, 3 Monaten und 1 Jahr mit dem unbehandelten Defekt auf der Gegenseite verglichen. Die Untersuchung beinhaltete den makroskopischen und histologischen Vergleich mit Hilfe des O’Driscoll Score sowie immunhistologische Untersuchungen und die Ermittlung der Genexpression mittels PCR.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Weder bei den matrixgedeckten Defekten noch bei der alleinigen Abrasion konnte eine vollständige Defektdeckung im zeitlichen Verlauf beobachtet werden. Alle mit dem komprimierten Kollagengel behandelten Defekte zeigten eine Regeneratbildung. Im zentralen Bereich der Trochlea wurde ein oberflächlicher Abrieb beobachtet. In der Kontrollgruppe zeigte sich ein teilweise ausgedehnter narbiger Defekt. Die histologische Aufarbeitung zeigte für die mit komprimierten Matrizes behandelten Defekte ein homogenes zellreiches Regenerat ohne den typischen zonalen Aufbau hyalinartigen Knorpels. Die Kontrolldefekte zeigten während des Untersuchungszeitraums ein zellarmes faseriges Regenerat mit schweren Fissuren und Vakuolenbildung. Die O’Driscoll Einzelscores und der Gesamtscore lagen im zeitlichen Verlauf für die Abrasion deutlich unter der Kollagengelgruppe. Die Kollagen-II- und Aggrecan-Genexpression lag im Matrixregenerat im Vergleich zum abradierten Kontrolldefekt deutlicher höher. Die Messwerte für die proinflammatorischen Zytokine TNFalpha, IL-1beta, IL-6 und der matrixdestabilisierenden Kollagenase MMP- 13 lagen nach 1 Jahr in der Kontrollgruppe deutlicher höher als in der Gruppe der matrixtransplantierten großflächigen Defekte.
Die Verwendung einer komprimierten zellbesiedelten Kollagengelmatrix zur Behandlung vollschichtiger großflächiger Knorpeldefekte am Tiermodell zeigt im Jahresverlauf erste vielversprechende klinische Ergebnisse im Vergleich zum unbehandelten Spontanverlauf.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR15-1196
doi: 10.3205/14dkou502, urn:nbn:de:0183-14dkou5027
Published: October 13, 2014
© 2014 Andereya et al.
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by G. H. | Feb 13, 2019 | Chirurgische Orthopädie, Konservative Orthopädie, News
Volumetrische Quantifizierung von Knorpelregeneraten mittels Ultraschallbiomikroskopie am Schafsmodell
Schöne M, Männicke N, Marquaß B, Aydogan E, Zscharnack M, Josten C, Schulz R, Raum K
Fragestellung: Zur Beurteilung von Knorpelregeneraten in experimentellen Studien gilt die histologische Untersuchung und Klassifizierung als der derzeitige Goldstandard. Nachteilig ist, dass es sich hierbei um die Beurteilung eines 2D Schnittbildes handelt welches als repräsentativ für den gesamten 3D Defekt gesehen wird. Hier bietet sich die Ultraschallbiomikroskopie (UBM) als additive Untersuchung an, da sie nicht-destruktiv eine 3D Abbildung der gesamten Knorpelschicht ermöglicht. Daraus abgeleitete volumetrische Daten sollten in dieser Studie genutzt werden, um Knorpelregenerate retrospektivisch zu charakterisieren.
Methodik: An 32 Schafen wurde an beiden medialen Femurkondylen je ein vollschichtiger Knorpeldefekt (7 mm Durchmesser) gesetzt. Im Anschluss erfolgte die Versorgung mit einem stammzellbesiedelten Kollagen-I-Hydrogel (Fa. Arthro Kinetics) oder einem unbesiedelten Leergel, die kontralaterale Seite blieb als Kontrolle unbehandelt.
Nach 1- bzw. 2-jähriger Standzeit erfolgte die verblindete Explantation der Kondylen. Nach makroskopischer Beurteilung wurde die Defektregion mit einem portablen UBM (laterale Auflösung 50 µm) gescannt. Die Auswertung der 3D Datensätze erfolgte mit eigens entwickelter Software.
Zunächst wurden die Oberfläche und der Knorpel-Knochenübergang automatisch rekonstruiert, gefolgt von manueller Kontrolle und Korrektur bei Bedarf. Auf Grundlage der rekonstruierten Flächen außerhalb des Defektbereiches wurden die präoperativen Verläufe von Oberfläche und Knorpel-Knochenübergang im Defektbereich abgeschätzt. Anhand der Differenzen zwischen den prä- und postoperativen Grenzflächen wurden Knorpeldicke und die Volumina von entferntem Gewebe, neuem Gewebe, hypertropher Ossifikation, Zysten und neuem knorpelartigem Gewebe berechnet.
An 6 Datensätzen von gesundem Gelenkknorpel wurde die Methode zum Abschätzen der präoperativen Grenzflächen überprüft und deren Genauigkeit quantifiziert.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Der mittlere Fehler aufgrund der Abschätzung der Grenzflächen lag bei 0,6%, die maximale Abweichung bei 1,5%.
Die operierten Schafsproben wiesen eine Knorpeldicke von 0,98 ± 0,29 mm auf. Das entfernte Volumen lag bei 31,6 ± 9,9 mm³, ohne signifikante Unterschiede bezüglich Standzeit und Seite. Die relative Defektfüllung war nach einem Jahr Standzeit mit 64 ± 19% signifikant kleiner als nach zwei Jahren mit 79 ± 11%. Davon blieb der Anteil hypertropher Ossifikation mit 10 ± 12% (Median ± IQR) über beide Jahr unverändert, die Menge des neuen knorpelartigen Gewebes nahm jedoch signifikant zu. Das Volumen von Zysten war nach einem Jahr signifikant größer als nach zwei Jahren (5,9 vs. 2,5 mm³).
Durch die UBM-Daten konnten erstmals Volumendaten zur Knorpelregeneration und Defektsetzung am Großtier gezeigt werden. Aus knorpelregenerativer Sicht ist eine signifikante Zunahme der Defektfüllung zwischen erstem und zweitem Jahr interessant. Die UBM stellt eine sinnvolle Ergänzung zur histologischen Untersuchung dar und übertrifft die Auflösung experimenteller Hochfeld-MRT.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR15-1059
doi: 10.3205/14dkou501, urn:nbn:de:0183-14dkou5011
Published: October 13, 2014
© 2014 Schöne et al.
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by G. H. | Jän 10, 2019 | Chirurgische Orthopädie, Konservative Orthopädie, News
Glucosaminsulfat reduziert die Matrixmetalloproteinasen-Expression von Osteosarkomzellen in vitro
Ulrich J, Pohlig F, Lenze U, Schauwecker J, Lenze F, von Eisenhart-Rothe R
Fragestellung: Das invasive Wachstum und die schnelle Metastasierung von Osteosarkomen steht in enger Verbindung mit der vermehrten Expression von Matrixmetalloproteinasen (MMPs). In diesem Zusammenhang besonders hervorzuheben sind MMP 2, 3, und 9. Die Hemmung dieser MMPs kann das Metastasierungsrisiko von Osteosarkomen reduzieren. In arthrotischen Gelenken konnte die Hemmung dieser MMPs durch Glucosaminsulfat bereits nachgewiesen werden. Ziel dieser Studie war es, in vitro den Einfluss von Glucosaminsulfat auf die Expression von MMP 2, 3 und 9 in Osteosarkomzellen zu untersuchen.
Methodik: Etablierte Osteosarkomzelllinien (SaOs-2 und MG-63) wurden für 3 Tage nach Herstellerangaben kultiviert und anschließend auf Zellkulturplatten ausgesiedelt. Nach 24 h wurde das Medium gewechselt und Glucosaminsulfat in den Konzentrationen 10, 50 und 100 µg/ml zugegeben. Die Zellen der Kontrollprobe wurden mit normalem Medium kultiviert. Nach 42 h wurden die Zellen mit Trypsin gelöst und die RNA isoliert. Nach Umschreibung in cDNA konnte eine relative Quantifizierung mittels real-time PCR durchgeführt werden. Des Weiteren erfolgte eine zusätzliche Quantifizierung von MMP 3 und 9 aus Zelllysat mittels ELISA. Auf Bestimmung von MMP 2 mittels ELISA wurde aufgrund der nur marginalen Unterschiede in der real-time PCR verzichtet. Zur Beurteilung der Zellviabilität wurde zudem eine colorimetrische Messung mittels WST-Assay durchgeführt.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Sowohl bei MG-63- als auch bei SaOs-2-Zellen zeigte sich eine signifikante aber nicht konzentrationsabhängige Downregulaton der Expression von MMP 3 durch Glucosaminsulfat (p<0,05). Ähnliche Ergebnisse konnten wir für MMP 9 erzielen, allerdings ohne statistische Signifikanz. Auch hier zeigte sich keine Abhängigkeit von der Glucosaminsulfatkonzentration. Die Expression von MMP 2 wurde durch Glucosaminsulfat kaum beeinflusst. Im ELISA konnten die PCR-Ergebnisse für MMP 3 und 9 bestätigt werden.
Die Zellviabilität wurde durch Glucosaminsulfat in den von uns verwendeten Konzentrationen nicht beeinflusst.
Die vorliegende Studie zeigt erstmalig eine Downregulation von MMP 3 und 9 in Osteosarkomzellen durch Glucosaminsulfat. Dies konnte sowohl auf RNA- als auch auf Proteinebene nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse lassen auf eine verminderte Invasivität der mit Glucosaminsulfat behandelten Tumorzellen und somit eine mögliche Verminderung des Metastasierungsrisikos von Osteosarkomen schließen.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR13-1300
doi: 10.3205/14dkou488, urn:nbn:de:0183-14dkou4887
Published: October 13, 2014
© 2014 Ulrich et al.
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