by R-Dorotka | Apr 3, 2019 | Chirurgische Orthopädie, Konservative Orthopädie, News
In-vitro Studie zur individuellen lokalen Freisetzung verschiedener Antibiotika gegen bakterielle Erreger einsatzbedingter Osteomyelitiden
Back DA, Calafi A, Bormann N, Garbe LA, Schmidmaier G, Willy C, Wildemann B
Fragestellung: Die häufigsten Verwundungen von Soldaten in Afghanistan betreffen das muskuloskeletale System. Zur Verhinderung von Osteomyelitiden ist ein chirurgisches Debridement mit additiver systemischer Antibiotikagabe das Mittel der ersten Wahl. Dieses Konzept könnte durch eine zusätzliche lokale Antibiotikafreisetzung von Implantaten ergänzt werden. Diese in-vitro Studie sollte die Möglichkeiten einer bestehenden Implantatbeschichtung erforschen, unterschiedliche Antibiotika einzeln oder in Mehrfachbeschichtung wirkungsvoll gegen einsatzrelevante Osteomyelitiserreger freizusetzen.
Methodik: Titan-Kirschner-Drähte wurden mit Poly(D,L-Laktid) (PDLLA) und verschiedenen Antibiotika (Abx)-Konzentrationen (3 pro Abx) Ciprofloxacin, Gentamicin, Colistin, Daptomycin und Cefoxitin beschichtet, bei 37°C in NaCl eluiert und nach 4 h, 1, 3, 7, 14, 28 und 42 Tagen Proben entnommen (n=6). Mit den Eluaten wurde eine Hemmhofbestimmung nach Kirby-Bauer gegen gram-positive (Staph. aureus, MRSA) oder gram-negative (Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa) Bakterienstämme durchgeführt. Die Abx-Konzentrationen in den effektivsten Elutionsreihen wurden mittels Massenspektrometrie oder KIMS-Verfahren quantifiziert. In einem weiteren Ansatz wurden Doppelbeschichtungen mit Gentamicin und Colistin (n=6) gegen eine simulierte Mischinfektion mit Staph. aureus und einem multiresistenten A. baumannii getestet. Um toxische Effekte auf Knochenzellen auszuschließen, wurden Osteoblasten mit den verschiedenen Konzentrationen der jeweiligen Abx kultiviert. Die metabolische Aktivität und die alkalische Phosphatase wurden nach 3 Tagen gemessen.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Als Beschichtungskonzentrationen mit den effektivsten bakterienhemmenden Eigenschaften wurden 10% w/w für Gentamicin, Colistin und Ciprofloxacin, sowie 40% w/w für Daptomycin identifiziert. Außer Daptomycin zeigten alle Abx einen initialen Burst-release mit kontinuierlicher Freisetzung über 42 Tage. Daptomycin wies eine gesteigerte Freisetzung innerhalb der ersten 24h auf. Cefoxitin führte in keiner Beschichtungs-Konzentration zu einem inhibitorischen mikrobiologischen Effekt und war auch in der Freisetzungskinetik nur gering nachweisbar. Die Doppelbeschichtung mit Gentamicin und Colistin führte zu einer effektiven Freisetzung beider Antibiotika mit nachweisbarer Bakterienhemmung. Keine der Konzentrationen zeigte einen inhibitorischen Effekt auf Osteoblasten in-vitro.
Diese Studie zeigt, dass die Möglichkeit besteht, mittels PDLLA Antibiotikabeschichtungen für Implantate herzustellen, die auch individuellen Keimspektren angepasst sind. Hierbei sind auch Doppel-Beschichtungen mit Antibiotika möglich. Bei den Implantatbeschichtungen ist das Mengenverhältnis eingearbeiteter Medikamente zu berücksichtigen, ferner bei der Freisetzungskinetik die Halbwertszeit der Antibiotika. Die Ergebnisse unterstützen eine weitere Erforschung der gewählten Beschichtungen zur Bekämpfung von Osteomyelitis-induzierenden einsatzrelevanten Bakterienstämmen.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR17-1440
doi: 10.3205/14dkou523, urn:nbn:de:0183-14dkou5231
Published: October 13, 2014
© 2014 Back et al.
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by R-Dorotka | Apr 3, 2019 | Chirurgische Orthopädie, Konservative Orthopädie, News
In vitro Untersuchung neuer Antibiotika-Kombinationen mit Calciumsulsphat zur lokalen Behandlung von Knochen- und Gelenksinfekten. Die nahezu konstante Freisetzung von Ceftriaxon bietet neue Behandlungsmöglichkeiten
Rönn K, Wahl P, Bohner M, Decosterd L, Festa S, Gautier E
Fragestellung: Antibiotika werden bei Knochen- und Gelenksinfekten lokal eingesetzt, um die Probleme einer schlechten Penetration zu umgehen und das Risiko einer Organtoxizität bei systemischer Verabreichung zu vermeiden. Zusätzlich kann die Trägersubstanz dazu beitragen, postoperativen Totraum zu füllen. Klassisch lokal eingesetze Aminoglykoside wie Gentamicin oder Glykopeptide wie Vancomycin erlauben aber nicht alle Infekte adäquat abzudecken. Die Standart-Trägersubstanz ist bis heute PMMA-Zement, wodurch zusätzliche Operationen zur Entfernung nötig werden. Ausserdem wird das Antibiotikum nur zu Beginn in therapeutischen Dosen freigesetzt. Als bessere Substanz bietet sich Calciumsulphat (CaSO4) an. Es ist mit verschiedenen Antibiotika kompatibel, löst sich über die Zeit auf und kann resorbiert werden. Das Ziel dieser Studie war es, neue Kombinationen von Calciumsulphat mit verschiedenen Antibiotika, deren Freisetzung über die Zeit, antimikrobielle Aktivität sowie Stabilität in vitro zu bestimmen.
Methodik: Antibiotika-CaSO4-Kugeln wurden gemäss bekannter Methoden hergestellt. Das Verhältnis des Antibiotikums zum CaSO4-Hemihydratpulvers war 8%, die Zugabe von demineralisiertem Wasser erfolgte gemäss Bedarf, um das Material verarbeiten zu können. Überschüssiges Wasser wurde durch Dessikation vor dem Elutionsexperiment entfernt. Die gewählten Antibiotika waren Flucloxacillin, Piperaccillin/Tazobactam, Cefuroxim, Ceftriaxon, Ceftazidim, Cefepim, Meropenem, Ciprofloxacin, Levofloxacin und Clindamycin. Das Elutionsexperiment erfolgte über 6 Wochen, zuerst in PBS-Lösung, anschliessend in Rinderplasma, was mit Enoxaparin antikoaguliert wurde. Die Bestimmung der Antibiotikakonzentration erfolgte mit LC-MS/MS in regelmässigen Abständen aus der täglich gewechselten Elutionsflüssigkeit. Diese Chromatographieresultate wurden durch Agardiffusionstests bestätigt, je nach Antibiotikaspektrum mit S.aureus ATCC 25922 oder E. coli ATCC 35218.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Piperacillin-Tazobactam, Ceftazidim, Cefepim sowie Meronem zeigten eine rasche Reduktion der Konzentration sowie der Aktivität. Flucloxacillin und Cefuroxim blieben in klinisch relevanten Konzentrationen über 4 Wochen präsent. Ciprofloxacin und Levofloxacin sogar für 6 Wochen, wenn auch in zunehmend abnehmenden Konzentrationen. Diese liegen anfangs aber in einem Bereich, wo lokale Zelltoxizität zu erwarten ist. Flucloxacillin, Cefuroxim sowie Clindamycin könnten klinischen Einsatz finden, vor allem, wenn eine begrenzte Wirkungsdauer von Tagen bis Wochen erwünscht ist.
Herausstechend zeigte sich Ceftriaxon, wo eine nur leichte Abnahme der Konzentration von ca. 130 mg/l auf ca. 75 mg/l über 6 Wochen erfolgte, bei einer anhaltend hohen antimikrobiellen Aktivität.
Dieses Experiment eröffnet neue Möglichkeiten zum lokalen Einsatz von Antibiotika mit CaSO4 als resorbierbare Trägersubstanz. Insbesondere ist die fast konstante Freisetzung von Ceftriaxon von grossem Interesse, da hohe Konzentrationen über 6 Wochen beobachtet wurden.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR17-268
doi: 10.3205/14dkou522, urn:nbn:de:0183-14dkou5224
Published: October 13, 2014
© 2014 Rönn et al.
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by G. H. | Mrz 25, 2019 | Konservative Orthopädie, News
SDF1 induziertes Homing von adipose derived stem cells (ASC) in der Wundheilung
Koenen P, Lipensky A, Thamm O, Bouillon B, Fuchs P, Neugebauer EAM, Stürmer EK
Fragestellung: Die Prävalenz chronischer Wunden nimmt aufgrund der demographischen Entwicklung in industrialisierten Ländern stetig zu. Einer der pathophysiologischen Mechanismen ist das gestörte Homing von Stammzellen zur Wunde. In diesem Projekt sollten der SDF1/CXCR4-Pathway, für den in hämatopoetischen Progenitorzellen bereits ein migratorischer Einfluss nachgewiesen wurde, sowie der neuere SDF1/CXCR7-Pathway in ASC fokussiert werden.
Methodik: Humane ASC wurden in vitro mit Wundsekret akuter (AWF) und chronischer (CWF) Wunden inkubiert. Mittels Transwell-Migrationsassay und qRT-PCR wurden die ASC-Migration sowie die Expression verschiedener migrationsstimulierender und migrationshemmender Faktoren analysiert. Die Experimente wurden außerdem nach Präinkubation mit den Rezeptorantagonisten für CXCR4 und CXCR7 durchgeführt. Mittels ELISA wurde SDF1 sowohl in verschiedenen AWF- und CWF-Proben als auch im ASC-Überstand quantifiziert. Um interindividuelle Unterschiede zu analysieren, wurden die Versuche mit ASC von sieben humanen Donoren durchgeführt.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Die ASC zeigten immunzytochemisch eine Expression der Oberflächenmarker CD73, CD90, und CD105 bei Negativität für CD45 und konnten in Adipozyten differenziert werden. Während in AWF eine durchschnittliche SDF1-Konzentration von 73.5 pg/ml nachgewiesen werden konnte, war die SDF-Konzentration in allen CWF-Proben unterhalb der Nachweisgrenze. Im ASC-Überstand war SDF1 nach AWF-Inkubation signifikant erhöht, in CWF hingegen signifikant erniedrigt (AWF: 129.7 pg/ml; CWF: 30 pg/ml; ctrl: 95.5 pg/ml). Die Migration von ASC war durch AWF verglichen mit der Kontrolle signifikant erhöht, dieser Effekt wurde vom CXCR4- und CXCR7-Antagonisten gemindert. CWF hatte keinen migrationsinduzierenden Effekt auf ASC und die Rezeptorantagonisten hatten keinen Effekt. Unterschiede in der basalen und AWF-induzierten Migrationskapazität konnten für die verschiedenen Donoren gezeigt werden. CXCR4, CXCR7 und SDF1 wurden in ASC nach AWF-Inkubation signifikant höher exprimiert, während die Expression von TIMP3 vermindert war. Die CXCR4/CXCR7-Antagonisten schwächten diesen Effekt ab.
In-vitro ist die ASC-Migration im chronischen Wundmilieu vermindert. Eine gestörte SDF1/CXCR4-, sowie SDF1/CXCR7-vermittelte Stammzellmigration scheint dabei eine wesentliche Rolle zu spielen und könnte so zumindest teilweise die verzögerte Heilung chronischer Wunden erklären. Außerdem konnte eine Donorspezifität der ASC-Migration in Abhängigkeit von individuellen Erkrankungen/Faktoren gezeigt werden.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR17-957
doi: 10.3205/14dkou521 , urn:nbn:de:0183-14dkou5211
Published: October 13, 2014
© 2014 Koenen et al.
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by G. H. | Mrz 25, 2019 | Konservative Orthopädie, News
Molekulare Grundlagen der durch blaues Licht induzierten Differenzierungshemmung humaner Fibroblasten zu Myofibroblasten
Krassovka J, Suschek C, Windolf J
Fragestellung: Profibrotische Störungen, wie z.B. die Bildung von Keloiden oder hypertrophen Wundnarben basieren zumeist auf einer gestörten Regulation der Proliferation und/oder Differenzierung von Fibroblasten zu Myofibroblasten. In früheren Studien konnten wir zeigen, dass Bestrahlung mit blauem Licht (453 und 474 nm) bereits in subletalen Dosen eine signifikante Erniedrigung der TGF-beta-induzierten Differenzierung von Fibroblasten zu Myofibroblasten bewirkte. Der Untersuchungsschwerpunkt der aktuellen Studie war die Rolle des Flavin-haltigen Proteins NADPH-Oxidase 4 (NOX4), welches auf der Basis der Generierung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) eine zentrale Schaltstelle des für die Fibroblastendifferenzierung essenziellen TGF-beta-Signalwegs darstellt.
Methodik: Verwendet wurden humane dermale Fibroblasten (FB) sowie Fibrosarkomzellen der Zelllinie HT1080. Bestrahlungen erfolgten unter Verwendung eines hochintensiven LED-Arrays (453 nm in subletalen Dosen von max. 80 J/cm2). Mit zellbiologischen Methoden (Immunproteinchemie) sowie molekularen Methoden (Western, RT-PCR) untersuchten wir die Photoeffekte der verwendeten Lichtquelle auf den molekularen Mechanismus der Differenzierung von Fibroblasten zu Myofibroblasten. Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) wurden mittels Durchflusszytometrie und Fluorometrie detektiert. Als Parameter der NADPH-Oxidase-Aktivität haben wir photometrisch die Konzentrationen von NADP+ und NADPH quantifiziert.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: In Folge einer Differenzierungsinduktion von Fibroblasten mittels TGF-beta beobachteten wir eine leicht erhöhte intrazelluläre Produktion von ROS. Durch eine Bestrahlung der Zellen mit blauem Licht (max. 80 J/cm2) konnten wir eine wesentlich stärkere und über sechs Stunden anhaltende Erhöhung der intrazellulären ROS-Generierung beobachten. Diese starke Erhöhung der ROS-Produktion korrelierte zugleich mit einer mehr als 80%igen Hemmung der TGF-beta-abhängigen Fibroblastendifferenzierung. Die oben erwähnte intrazelluläre ROS-Produktion konnte aufgrund des langen Zeitintervalls nicht das primäre Ergebnis der Lichtexposition sein, sondern spiegelt vielmehr einen induzierten intrazellulären enzymatischen Prozess wider. Parallel zu der beschriebenen ROS-Produktion beobachteten wir in TGF-beta-aktivierten FB-Kulturen eine langandauernd erhöhte NOX4-Aktivität, wohingegen in den zusätzlich bestrahlten FB-Kulturen die NOX4-Aktivität über den beobachteten Zeitraum von sechs Stunden weit unter der Ausgangsaktivität lag. Da Flavinproteine, wie z.B. die NOX4, ein Absorptionsmaximum bei etwa 453 nm haben, postulieren wir hier einen Mechanismus, der eine Licht-induzierte Strukturveränderung des Flavin-haltigen Enzyms beinhaltet und dadurch zu einer Unterbrechung der TGF-beta-induzierten Differenzierungskaskade führt.
Durch die hier erwähnte lichtspektrumspezifische Modulation von Schlüsselenzymen der Fibroblastendifferenzierung sind wir in der Lage ein fibrotisches Ereignis effektiv, spezifisch sowie nebenwirkungs- und pharmafrei zu hemmen.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR17-1341
doi: 10.3205/14dkou520 , urn:nbn:de:0183-14dkou5201
Published: October 13, 2014
© 2014 Krassovka et al.
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by G. H. | Mrz 25, 2019 | Konservative Orthopädie, News
Nicht-thermische Plasmaquellen in der Wundbehandlung
Opländer C, Heuer K, Baldus S, Demir E, Fuchs P, Awakowicz P, Windolf J, Suschek CV
Fragestellung: Nicht-thermische Plasmaquellen unter Atmosphärendruck ermöglichen eine Behandlung menschlichen Gewebes. Die erzeugten Gasplasmen bestehen aus reaktiven Molekülen (u. a. Stickstoffmonoxid, Stickstoffdioxid, Ozon) sowie Ionen, Elektronen und UV-Strahlung. Das Stickstoffmonoxid (NO) besitzt eine Schlüsselfunktion in der Wundheilung d.h. eine verminderte NO-Produktion ist mit einer gestörten Wundheilung assoziiert. Auch das im Plasma gebildete Stickstoffdioxidradikal NO2 könnte neben NO wundheilungsrelevante Mechanismen beeinflussen. Die Wechselwirkung von Plasmas mit humanem Gewebe kann zur Bildung und Anreicherung unterschiedlicher wundheilungsrelevanter NO-Derivate (Nitrit und S-Nitrosoverbindungen) im behandelten Gewebe führen. Vorklinische Studien zur Nutzung von exogen applizierten NO/NO-Derivate zur Wundbehandlung zeigten bereits vielversprechende Ergebnisse.Daher haben wir in einer experimentellen Studie den möglichen Einsatz NO-haltiger Atmosphärendruckplasmen in der Wundbehandlung untersucht.
Methodik: NO und NO-Derivate wurden mittels Chemiluminseszenz-Detektion quantifiziert.
Die Penetration von NO durch Spalthaut bzw. Dermis wurde in Franz-Kammerversuchen bestimmt. Mögliche Toxizität bzw. DNA-Schäden wurden MTT und TUNEL-Assays an Hautpräparaten und einem 3D-Hautersatzmodel untersucht.
Mittels eines O2C-Geräts wurde der Einfluss einer Plasmabehandlung auf die dermale Mikrozirkulation am Probanden untersucht.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Im Kaltplasma einer definierten DBD-Plasmaquelle (Dielectric Barrier Discharge) konnten wir eine Generierung relevanter Konzentrationen von NO (400 ppb) und NO2 (100 ppm) nachweisen. Auch nach längeren Plasmabehandlungen konnte keine Toxizität oder DNA-Schäden in humanen Voll-, Spalt- und Dermispräparaten sowie einem 3D-Hautersatzmodel nachgewiesen werden. Daher kann eine Gefährdung des Patienten durch eine Behandlung mit dieser Plasmaquelle als unbedenklich eingeschätzt werden. Plasmaexpositon führte zu einer transepidermalen Penetration von NO (max. 162±49 nmol/cm²) und zu einer Anreicherung mit NO-Derivaten in der Epidermis sowie der unterliegenden Dermis (2,4±0,3 nmol/mg). Der Haut oder Blutserum pH-Wert konnte in vitro durch Plasmaexposition gesenkt werden (bis zu -0.3±0.5). In vivo konnte eine Erhöhung der lokalen Mikrozirkulation der plasmabehandelten Haut gesehen werden (124±43%). Die dermale Penetration von NO und Anreicherung des Gewebes mit NO-Derivaten weisen auf eine Anwendungsrelevanz der verwendeten Plasmaquellen für den klinischen Einsatz hin. Insbesondere wegen der beschriebenen antibakteriellen Wirkung, der positiven Beeinflussung der lokalen Mikrozirkulation über NO sowie einer möglichen Ansäuerung der Wunde könnte der Heilungsverlauf moduliert und positiv beeinflusst werden. Daher stellen nicht-thermische Plasmaquellen bzw. NO-haltige Atmosphärendruckplasmen vielversprechende und preiswerte Therapiealternativen in der Behandlung und Vorbeugung von infizierten und chronischen Wunden dar.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR17-235
doi: 10.3205/14dkou519 , urn:nbn:de:0183-14dkou5196
Published: October 13, 2014
© 2014 Opländer et al.
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by G. H. | Mrz 19, 2019 | Chirurgische Orthopädie, Konservative Orthopädie, News
Molekulare Grundlagen der Beeinflussung hämodynamischer Parameter durch blaues LED-Licht in vitro und in vivo
Volkmar CM, Kotte K, Opländer C, Deck A, Born M, Liebmann J, Windolf J, Suschek C
Fragestellung: Eine gestörte Hämodynamik im Wundmilieu korreliert häufig mit einer verzögerten/gestörten Wundheilung; wohingegen durch exogene Applikation von Stickstoffmonoxid (NO) ein gestörter venöser sowie arterieller Blutfluss verbessert werden kann. Wir haben erstmals in vitro sowie in vivo den Einfluss der in der menschlichen Haut durch blaues Licht induzierten nicht-enzymatischen NO-Freisetzung auf die lokale Hämodynamik des lichtexponierten Hautareals untersucht.
Methodik: Es wurden in vivo-Studien an gesunden Probanden und in vitro-Studien an humanen Hautexplantaten und artifizieller humaner Epidermis durchgeführt. Für alle Studien liegen positive Ethikvoten vor. Als Lichtquelle diente ein LED-Array (light emitting diodes), welches gepulstes sowie ungepulstes Licht der Wellenlänge 453 nm emittierte. Die Bestimmung von NO und seiner bioaktiven Derivate (nitrosierte Thiole) erfolgte mittels Chemilumineszenz-Detektion. Toxizität wurde mittels MTT- und TUNEL-Assay quantifiziert. Der lokale Blutfluss wurde in vivo nichtinvasiv mittels eines Mirco-light Guide Spektrophotometers charakterisiert. Es wurden 100 µM Nitrit-Creme bzw. Nitrit-Lösung auf der Hautoberfläche aufgetragen.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Die Bestrahlung mit blauem LED-Licht mit Dosen von bis zu 250 J/cm2 führte in den Hautpräparaten zu keinen nekrotischen oder apoptotischen Ereignissen. Die Zellvitalität blieb unverändert. Weiterhin zeigten wir, dass blaues Licht in der Lage ist sowohl in vitro in bestrahlten Lösungen sowie in vivo in bestrahlter menschlichen Haut photolabile NO-Derivate (nitrosierte Thiole) zu NO zu spalten. Den zugrundeliegenden Mechanismus des Photozerfalls haben wir aufgeklärt. Weiterhin fanden wir eine eindeutige Korrelation zwischen der erwähnten Licht-induzierten kutanen NO-Generierung und einem signifikanten erhöhten (über 80 %) lokalen Blutfluss in oberflächlichen (1-2 mm) sowie tieferen (6-8 mm) Hautregionen. Dabei zeigte sich, dass bezüglich der Blutflusserhöhung die intrakutane Einbringung höherer Lichtenergien durch die Verwendung gepulster Lichtquellen einen eindeutigen Vorteil gegenüber konstanten Lichtquellen hatte. Darüberhinaus konnten vor der Strahlung aufgetragene Nitrit-Lösungen den kutanen NO-Speicher sowie die erwähnte Steigerung des Blutflusses erhöhen.
Diese Ergebnisse zeigen, dass blaues LED-Licht nebenwirkungsarm die Durchblutungsrate der Haut signifikant steigert, wobei gepulstes Licht sich trotz minimalem Temperaturanstieg an der Hautoberfläche am effektivsten erweist. Dieser Anstieg korreliert mit der Menge der intrakutan erzeugten NO-Rate sowie der Menge bioaktiver NO-Derivate im bestrahlten Hautareal.
Aufgrund der beobachtete Effekte bietet blaues Licht zur Steigerung der NO-abhängigen oberflächlichen, lokalen Durchblutung eine sinnvolle Ergänzung in der Therapie von Wunden, die durch eine hämodynamische Störung charakterisiert sind. Auch das zusätzliche Auftragen einer Nitrit-Lösung könnte in Betracht gezogen werden.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR17-1202
doi: 10.3205/14dkou518, urn:nbn:de:0183-14dkou5181
Published: October 13, 2014
© 2014 Volkmar et al.
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