by G. H. | Mrz 19, 2019 | Chirurgische Orthopädie, News, Schulter
Die Inhibition der Phosphodiesterase 5, jedoch nicht der Phosphodiesterase 3, reduziert die Gewebenekrose in kritisch perfundierten muskulokutanen Lappen am atherosklerotischen Mausmodell
Mörsdorf P, Schröder T, Pohlemann T, Menger M, Holstein JH
Fragestellung: Ischämiebedingte Mikrozirkulationsstörungen mit nachfolgender Nekrose stellen in der plastischen und rekonstruktiven Lappenchirurgie nach wie vor ein Problem dar, welches letztlich im partiellen oder vollständigen Lappenverlust münden kann. Neben Minderperfusion spielen Entzündung und endotheliale Dysfunktion dabei eine entscheidende Rolle. Insbesondere Patienten mit Atherosklerose weisen Perfusionsstörungen auf, welche diese Ischämie verstärken können. Ziel dieser Studie war es zu untersuchen, welchen Einfluss eine medikamentöse Präkonditionierung mit spezifischen Inhibitoren der Phosphodiesterase auf Mikrozirkulation und Perfusionsausfall eines random pattern flap unter atherosklerotischen Bedingungen hat.
Methodik: An ApolipoproteinE-defizienten Mäusen wurde ein random pattern flap gehoben und in einer Rückenhautkammer fixiert. Mittels repetitiver Fluoreszenzmikroskopie analysierten wir die Mikrozirkulation, wobei die Ausdehnung der Gewebenekrose sowie die funktionelle Kapillardichte jeweils im proximalen, zentralen und distalen Lappenanteil als Endpunkte dienten. Zusätzlich wurde am Versuchsende das Serum-Gesamtcholesterin bestimmt und mit dem des Wildtyps verglichen. Die Medikamentengabe erfolgte jeweils 24h vor Lappenhebung sowie an den ersten 4 Tagen des Versuchs. Die Tiere wurden randomisiert folgenden Versuchsgruppen zugeteilt: (I) Cilostazol (Phosphodiesterase (PDE)3-Inhibitor; 30mg/kgKG; n=11); (II) Sildenafil (Phosphodiesterase 5-Inhibitor; 5mg/kgKG; n=11); (III) NaCl-behandelte Kontrollgruppe (n=9).
Ergebnisse und Schlussfolgerung: In der Kontrollgruppe zeigte sich ein zunehmender Ausfall der kapillaren Perfusion in allen Lappenarealen, was letztendlich zu einer Lappennekrose von ca. 65% führte. Die mit Sildenafil als Inhibitor der PDE 5 präkonditionierten Tiere wiesen eine etwas höhere Kapillardichte auf, was zu einer signifikant reduzierten Lappennekrose ab dem dritten Beobachtungstag führte (41%; p<0,05). Bei den mit Cilostazol als PDE3-Inhibitor behandelten Tieren ließ sich in allen Lappenanteilen eine wesentlich geringere Kapillardichte verzeichnen, welche ab Tag 7 in einem vollständigen Erliegen der kapillaren Perfusion mündete. Die resultierte in einer Gewebenekrose von insgesamt 76%. Die Gesamtcholesterinkonzentrationen der ApoE-Knockout-Mäuse waren im Vergleich zum Wildtyp um den Faktor 18 bis 21 erhöht (p<0,001).
Unsere Ergebnisse zeigen, dass eine Inhibition der PDE 5 im kritisch perfundierten atherosklerotischen Mausmodell die Entstehung der Gewebenekrose vermindern kann. Dies stellt einen möglichen Ansatz dar, dem ischämiebedingten Lappenverlust bei Patienten mit manifester Atherosklerose vorzubeugen. Die Inhibition der PDE 3 führt hingegen zu einer weiteren Verschlechterung der Mikrozirkulation.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR17-1091
doi: 10.3205/14dkou517, urn:nbn:de:0183-14dkou5171
Published: October 13, 2014
© 2014 Mörsdorf et al.
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by G. H. | Mrz 19, 2019 | Hüfte + Endoprothetik, News
Mikrozirkulation nach offener (DHS) und minimalinvasiver (PCCP) extramedullärer Osteosynthese bei der pertrochantären Femurfraktur
Knobe M, Böhle F, Gradl G, Andruszkow H, Hildebrand F, Stromps JP, Pape HC
Fragestellung: Als universell verwendbares Implantat ist die DHS seit vielen Jahren bei der Versorgung pertrochantärer Femurfrakturen etabliert. Nachteilig ist jedoch das Weichteiltrauma im geriatrischen Patientengut nach offenem Vorgehen, mit teilweise hohen Raten an Wundinfektionen. Die winkelstabile und minimalinvasive Perkutane Kompressionsplatte (PCCP) verkörpert hierbei eine komplikationsarme Alternative. Die limitierte Sicht und die limitierten Freiheitsgrade bei kleinen Zugängen können jedoch bei unzureichender Expertise ebenfalls zur Schädigung der Weichteile führen, was dem Konzept der minimalinvasiven Chirurgie zuwider läuft. Eine intakte Mikrozirkulation des Weichgewebes ist dabei unstrittig Voraussetzung für eine komplikationslose Wundheilung. Ziel dieser Pilot-Studie war die Erfassung mikrozirkulatorischer Parameter des Weichteilmantels am proximalen Femur zur Quantifizierung des Weichteiltraumas nach offenem und minimalinvasivem Vorgehen.
Methodik: Bei 25 Patienten mit pertrochantärer Femurfraktur (12 DHS, 13 PCCP, Alter: 74 Jahre, m/w 10/15, ASA 3, A1/A2-Fraktur) wurde als prospektive Kohortenstudie in Rückenlage mithilfe eines standardisierten Messplans präoperativ und postoperativ (8, 24, 48, 96 Stunden) die lokale Mikrozirkulation am proximalen Femur erfasst (Oxygen To See, Laser-Doppler / Weißlichtspektroskopie, LEA-Medizintechnik, Gießen, Deutschland). Über eine Flachsonde wurde der Blutfluss (Flow) sowie die kapillar-venöse Sauerstoffsättigung (SO2) in Gefäßen mit einem maximalen Durchmesser von 100 µm an 9 Punkten in 2 mm und 8 mm Eindringtiefe gemessen. Die Ergebnisse wurden gemittelt und mit dem Wilcoxon-Mann-Whitney-Test auf Signifikanz geprüft.
Ergebnisse: Die Gesamt-Region des proximalen Femurs zeigte nach der DHS einen permanent höheren Flow und eine stationär geringere SO2 im Vergleich zur PCCP. Diese Konstellation konnte besonders in der potenziell diskriminativen Region offen versus untertunnelt 8 Stunden postoperativ detektiert werden (DHS: Flow 30 AU versus PCCP 21 AU; P=0.049) und blieb bis zur letzten Messung nach 4 Tagen erhalten. Sämtliche qualitativen (Geschlecht) wie quantitativen (Alter, Blutdruck, BMI) Einflussgrößen zeigten keine statistisch signifikante Korrelation in Bezug auf Flow und SO2. In der tiefen Gewebeschicht (8 mm) waren im Vergleich zur Oberfläche (2 mm) höhere mikrozirkulatorische Parameter zu detektieren (P<0.001). SO2- und Flow-Werte korrelierten jeweils eng miteinander (P<0.001). Die Werte der gesunden Seite für Flow und SO2 zeigten sich zeitlich konstant.
Schlussfolgerungen: Parameter der Mikrozirkulation am proximalen Femur zeigen signifikante regionale Unterschiede hinsichtlich offenem und minimalinvasivem Zugangsweg nach extramedullärer Osteosynthese der pertrochantären Femurfraktur. Diesbezüglich erwies sich die minimalinvasive Versorgung mittels PCCP als vorteilhaft. Mikrozirkulatorische Parameter sind hierbei relativ konstant und sensibel genug, um differente Weichteiltraumen zu detektieren.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR17-764
doi: 10.3205/14dkou516, urn:nbn:de:0183-14dkou5162
Published: October 13, 2014
© 2014 Knobe et al.
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by G. H. | Mrz 11, 2019 | Konservative Orthopädie, News
Die Wahl des Hydrogels reguliert die differenzielle Syntheseleistung humaner Chondrozyten unter biomechanischer Stimulation
Rothdiener M, Felka T, Uynuk-Ool T, Fischer A, Aicher WK, Stöckle U, Grodzinsky AJ, Rolauffs B
Fragestellung: Der hyaline Gelenkknorpel ist ein druck- und biegungselastisches, gefäßloses Stützgewebe. Seine Zellen, die Chondrozyten, sind für die Produktion, Erhaltung und Reparatur der extrazellulären Matrix (EZM) verantwortlich. Die perizelluläre Matrix (PZM), die die Chondrozyten innerhalb der EZM umgibt, überträgt biomechanische und biochemische Signale zwischen der Zelle und der EZM1. Die Erkrankung der Osteoarthrose (OA) geht mit der Degeneration von EZM und PZM einher. Wir haben gezeigt, dass OA-Chondrozyten ohne PZM in vitro in ihren zellulären Funktionen OA-Chondrozyten mit PZM unterlegen sind [1]. In der vorliegenden Studie untersuchten wir die Auswirkung biomechanischer Stimulation auf die Biosynthese von OA-Chondrozyten mit PZM, auch in Abhängigkeit des OA-Grads. Die Eignung von arthrotischem Knorpelgewebe für die autologe Therapie sollte so überprüft werden.
Methodik: Chondrozyten mit PZM wurden im Zuge von Kniegelenkersatz enzymatisch aus humanem Knorpelgewebe gewonnen (n=42; Mittel: 68 Jahre). Die Zellen wurden entweder in einem Peptid Hydrogel (Sequenz AcN-KLDLKLDLKLDL-CNH2) oder einem Dextran Hydrogel (Cellendes, Reutlingen) unter Standardbedingungen (F12:DMEM 1:1, 10% FCS, 0,1% Ascorbat) kultiviert und biomechanisch stimuliert (6 Wochen intermittierend, 2.5% dynamische Kompression). Synthese und Abbau von Kollagen II wurden mittels CPII Propeptid bzw. C2C Neoepitop ELISA (Ibex, CAN) bestimmt, der Glycosaminoglycan (GAG) -Gehalt mittels Dimethylmethylenblau (DMMB) -Assay. Der OA-Grad wurde mit Hilfe der Kellgren-Lawrence Skala quantifiziert.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: In unstimulierten Peptid Hydrogel Kulturen korrelierte die Kollagen II Synthese mit dem OA-Grad (p<0,05). Biomechanisch stimulierte Chondrozyten produzierten im Vergleich zu unstimulierten Kontrollen signifikant höhere Mengen an CPII (p<0,05) und C2C (p<0,05). Dabei konnten Kulturen mit ohnehin guter Kollagen II Synthese durch Stimulation nicht gesteigert werden, während Kulturen mit geringer Kollagen II Synthese durch Stimulation signifikant (p<0,05) gegenüber den Kontrollen auf das Niveau der guten Kulturen gesteigert werden konnten. Die GAG Synthese konnte durch Stimulation im Peptid Hydrogel nicht gesteigert werden. Im Gegensatz dazu synthetisierten die im Dextran Hydrogel stimulierten Chondrozyten signifikant höhere Mengen an GAG (p<0,05) als die unstimulierten Kontrollen. Die Kollagen II Synthese stieg hingegen erst nach 6 wöchiger Stimulation gegenüber der Kontrolle signifikant an (p<0,05).
Die Art des gewählten Hydrogels war verantwortlich für die differenzielle Hochregulation der Kollagen II bzw. GAG Synthese unter biomechanischer Stimulation. Diese zeigte auch eine Abhängigkeit von der Schwere der OA. Generell konnten arthrotische Chondrozyten mit PZM unter Erhaltung ihrer Funktion effektiv isoliert und kultiviert werden.
Literatur
1.Rothdiener M, et al. OA-Chondrone übertreffen OA-Chondrozyten in ihrer zellulären Funktion: eine Rolle im Tissue Engineering? In: Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2012). Berlin, 23.-26.10.2012. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2012. DocGR19-859. DOI: 10.3205/12dkou488
2.Poole CA. Articular cartilage chondrons: form, function and failure. J Anat. 1997 Jul;191 (Pt 1):1-13. DOI: 10.1046/j.1469-7580.1997.19110001.x
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR16-987
doi: 10.3205/14dkou514 , urn:nbn:de:0183-14dkou5147
Published: October 13, 2014
© 2014 Rothdiener et al.
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by G. H. | Mrz 11, 2019 | News, Spezifische Orthopädie
Vergleich von plättchenreichem Plasma (PRP) und Thrombozytenlysat (TL) zur Stimulation von humanen Tenozyten in vitro
Schmidt T, Klatte F, Scheffler S, Wildemann B, Pruss A
Fragestellung: Die Nutzung von PRP zur Stimulation der Heilung ist trotz fehlender Evidenz eine häufig angewandte Therapieform. TL stellen eine Alternative zum PRP dar. Zur Herstellung werden durch Apherese gewonnene Thrombozytenkonzentrate mit einem Thrombozytengehalt von bis zu 1011 /ml verwendet. Diese werden eingefroren, was zur Lyse der Thrombozyten und Freisetzung der enthaltenen Wachstumsfaktoren führt. Das zellfreie, Wachstumsfaktor haltige TL wird in der Augenheilkunde schon erfolgreich eingesetzt. Vorteile zum PRP liegen neben dem höheren Thrombozytengehalt in der Lagerbarkeit. Dies ermöglicht repetitive Anwendungen und eine Analyse der Zusammensetzung und damit Standardisierung des Produktes vor der Anwendung
Methodik: PRP und TL eines männlichen und eines weiblichen Spenders wurden entsprechend den Herstellerangaben präpariert. Tenozyten aus Supraspinatussehnen-Biopsien von 4 männlichen und 4 weiblichen Spendern wurden 5 Tage mit 10% v/v PRP oder TL in Medium mit 2% FCS stimuliert. Als Positivkontrolle diente Medium mit 10% FCS, als Negativkontrolle Medium mit 2% FCS. Zu Beginn und am Ende der Stimulation wurde die Zellaktivität mittels Alamar Blue Test gemessen und an Tag 5 die RNA aus den Zellen isoliert. Mittels qRT-PCR wurde die Expression von Kollagen I, Kollagen III, Decorin, IL-1β und TNF-α ermittelt.
Statistik: Mann-Whitney U test, bonferroni-holm
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Der Thrombozytengehalt der TL lag mit 1,27 (männlich) bzw. 1,22 (weiblich) x1011/ml deutlich über dem der PRP’s mit 6,6 (männlich) bzw. 3,0 (weiblich) x108/ml.
Die Zellaktivität nach 5 Tagen war in allen Gruppen signifikant erhöht im Vergleich zur Negativkontrolle. Die Kollagen I Expression war in allen Gruppen niedriger im Vergleich zur Negativkontrolle, wobei die Kollagen I Expression in den Lysatgruppen signifikant höher war im Vergleich zu beiden PRP Gruppen. Die Kollagen III Expression wurde durch beide PRP’s sowie dem weiblichen TL signifikant erhöht im Vergleich zur Negativkontrolle.
Die Expression von Decorin und TNF-α ergab keine Unterschiede zwischen den Gruppen. Interessanterweise zeigte sich eine deutliche Erhöhung der IL-1β Expression in 6 von 8 Tenozytenkulturen nach Stimulation mit weiblichem PRP und in 2 von 8 Kulturen stimuliert mit männlichem PRP gegenüber der Negativkontrolle jedoch nicht nach TL Gabe. Dies konnte aufgrund der starken Schwankungen der Werte statistisch nicht verifiziert werden.
Eine verbesserte Zellaktivität der Tenozyten in vivo könnte die Sehnen-Heilung fördern. Inwiefern sich eine verringerte Kollagen I bzw. erhöhte Kollagen III Expression auf die Heilung auswirkt, müsste in weiteren Studien untersucht werden. PRP’s und TL stellen eine Möglichkeit zur Stimulation der Heilung dar, da sie wichtige Wachstumsfaktoren enthalten, keine Nebenwirkungen zeigen und kostengünstig sind. Der Vorteil des TLs ist zudem die Lagerbarkeit und somit eine mögliche repetitive Verwendung sowie die Möglichkeit zur Charakterisierung vor der Anwendung zur Standardisierung der Behandlung.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR16-1452
doi: 10.3205/14dkou513 , urn:nbn:de:0183-14dkou5131
Published: October 13, 2014
© 2014 Schmidt et al.
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by G. H. | Mrz 11, 2019 | News, Schulter
Hat Platelet Rich-Plasma (ACP) einen regenerativen Effekt auf Sehnenzellen der humanen Rotatorenmanschette?
Pauly S, Klatte F, Stahnke K, Greiner S, Scheibel M, Wildemann B
Fragestellung: Platelet rich- Plasma (PRP) wird in verschiedenen Anwendungsformen als körpereigene Augmentation für diverse muskuloskeletale Rekonstruktionen bzw. Regenerationsprozesse vertrieben- unter anderem als autologes konditioniertes Plasma (ACP, Arthrex). Hinsichtlich der Ergebnisse nach ACP-augmentierten Rotatorenmanschetten-Rekonstruktionen existieren klinische Studien mit heterogenem Resultat. Bisher liegt aber keine Untersuchung des ACP-Effektes auf Sehnenzellkulturen (Tenozyten) vor.
Gegenstand der Studie ist daher die Untersuchung von 1) Wachstumsfaktor-Gehalt von ACP, 2) Zellproliferation und Kollagen-Produktion von Tenozyten der humanen Rotatorenmanschette unter Einfluss von spenderindividuellem ACP.
Methodik: N=24 Tenozytenkulturen von Donor-Patienten beiderlei Geschlechts (je n=12 m/w) wurden nach etabliertem Protokoll kultiviert. Die periphervenöse Blutabnahme der Donor-Patienten mit nachfolgender Herstellung von ACP (Zentrifugation etc.) erfolgte nach Herstellerangaben zu einem späteren Zeitpunkt. Es handelt sich um die erste Studie von individuellem (nicht gepooltem) ACP an autologen Sehnenzellkulturen (patientenspezifisch).
Das frische ACP (nicht-gefroren) wurde
- quantitativ auf muskuloskeletale Wachstumsfaktoren untersucht (PDGF-AB, IGF-1, TGF-β1, BMP-7, BMP-12)
- dem intraindividuellen Zellpool plus Medium (FCS) zugeführt und nach 5d auf Zellwachstum (Alamar Blue Assay) und Collagen-I Synthese untersucht (vgl. Positiv-/Negativkontrolle).
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Im ACP wurden muskuloskeletale Wachstumsfaktoren nachgewiesen, die an der Sehnen-Knochen-Regeneration beteiligt sind. Wachstumsfaktoren der BMP-Familie wurden hingegen nicht in relevanter Menge nachgewiesen.
Eine ACP-abhängige Steigerung der Zellproliferation gegenüber den Kontrollkulturen wurde beobachtet.
Die Gesamt-Kollagen-I Produktion war unter Einfluss von ACP signifikant erhöht (relativiert zur Zellproliferation sign. reduziert).
ACP scheint auf Tenozyten der Rotatorenmanschette in vitro einen anabolen Effekt zu haben. Eine gesteigerte Produktion von Kollagen I am Footprint ist erwünscht, um eine belastbare Regeneration zu ermöglichen. Jedoch schwanken physiologisch die zellulären/viskösen Charakteristika des venösen Blutplasmas, also auch des produzierten PRP/ACP. Hier sind ggf. Standardisierungen sowie weitere in vitro- und klinische Untersuchungen notwendig, um den Effekt von PRP/ACP auf die RM-Regeneration abschliessend beurteilen zu können.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR16-802
doi: 10.3205/14dkou512 , urn:nbn:de:0183-14dkou5121
Published: October 13, 2014
© 2014 Pauly et al.
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by G. H. | Mrz 4, 2019 | Konservative Orthopädie, News
Autologe Tenozyten führen in Kombination mit einem resorbierbaren Kollagen-Scaffold zur verbesserten biomechanischen und histologischen Sehnenregeneration bei Rotatorenmanschettendefekten im Großtier
Roßbach BP, Pietschmann MF, Kempfert L, Ficklscherer A, Gülecyüz MF, Schmitt B, Ullamann T, Müller PE
Fragestellung: Die Regeneration von Rotatorenmanschettendefekten wird zum großen Teil durch die Gewebebiologie nach Rekonstruktion bestimmt. Hierbei führen unzureichende Vaskularisierung, Inflammation und Bildung von Ossifikationen zu Rerupturen und unbefriedigenden klinischen Ergebnissen. Eine neue Methode zur Sehnenregeneration stellt die Verwendung von autologen Tenozyten mit Scaffolds dar. Aufgrund der Größe sowie der Ähnlichkeit der Strukturen zur humanen Anatomie eignet sich hierbei das Großtiermodell am besten. Hypothese unserer Studie war, dass autologe Tenozyten in Kombination mit einem resorbierbaren Kollagen-Scaffold zu einer verbesserten biomechanischen und histologischen Sehnenregeneration von Rotatorenmanschettendefekten im Großtier führen.
Methodik: Nach Gewebebiopsie an der Patellasehne an acht Schafen, enzymatischer Verdauung und Kultivierung der Zellen in einer high-density Kultur wurden zehn Millionen autologe Tenozyten auf einem resorbierbaren Kollagen-Scaffold besiedelt und in einen critical-size-Defekt am Sehnen-Knochen-Übergang der rechten Infraspinatussehne dieser Tiere implantiert (Gruppe III). Als Vergleichsgruppen dienten jeweils acht Schafe mit Implantation eines unbesiedelten Scaffolds (Gruppe II) bzw. mit reiner Defektsetzung (Gruppe I). Die Euthanasie erfolgte 12 Wochen postoperativ und die gewonnenen Sehnenregenerate wurden biomechanisch und histologisch untersucht. Die kontralateralen Schultern dienten hierbei als Kontrollgruppe.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: In der biomechanischen Analyse wurde jedes Sehnenregenerat mit einer Vorlast von 10 N und einer Rate von 500 mm/min unter Dislokationskontrolle bis zum Versagen getestet. Bei gesunden Kontrollsehnen wurde eine durchschnittliche maximale Reißkraft von 2995 N ermittelt. Gruppe III mit besiedeltem Scaffold wies mit einem Durchschnittswert von 2516 N eine deutliche biomechanische Überlegenheit im Vergleich zu den Gruppen I mit Defektsetzung und II mit unbesiedeltem Scaffold mit 2004 N bzw. 2088 N auf. In der histologischen Aufbereitung konnte in Gruppe III im Gegensatz zu den beiden anderen Gruppen durch die Verwendung von autologen Tenozyten eine geringere Entzündungsreaktion, ein besser angeordneter Faserverlauf sowie eine vermehrte Kollagen- als auch Proteoglykan-Synthese im neuen Sehnenregenerat nachgewiesen werden.
Autologe Tenozyten führen in Kombination mit einem resorbierbaren Kollagen-Scaffold zur verbesserten biomechanischen und histologischen Sehnenregeneration gegenüber unbehandelten Defekten bzw. Defektauffüllung mit unbesiedeltem Scaffold bei Rotatorenmanschettendefekten im Großtier. Es könnte sich bei dieser Methode um einen vielversprechenden Ansatz zur Reparatur von nicht verschließbaren Sehnendefekten handeln.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR16-227
doi: 10.3205/14dkou511 , urn:nbn:de:0183-14dkou5111
Published: October 13, 2014
© 2014 Roßbach et al.
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