by G. H. | Feb 19, 2019 | Konservative Orthopädie, News
Simulation degenerativer und pro-inflammatorischer Bedingungen zur Testung der Zelltherapie im Bandscheiben-Organkultursystem
Neidlinger-Wilke C, Teixeira GPQ, Boldt A, Mollenhauer J, Wilke HJ, Barbosa MA, Ignatius A, Goncalves R
Fragestellung: Der Erfolg einer zelltherapeutischen Behandlung der Bandscheiben-degeneration erfordert die Überlebensfähigkeit und Aktivität injizierter Zellen in einer Umgebung, die durch geringe Nährstoffversorgung, niedrige Osmolarität und inflammatorische Bedingungen geprägt ist. Im bovinen Organkultursystem haben wir degenerative und inflammatorische Bedingungen simuliert und die Eignung dieses Ansatzes zur Testung des Schicksals injizierter Zellen unter diesen Bedingungen überprüft.
Methodik: Organkulturen aus bovinen Bandscheiben (je 5-6 Stück pro Präparat) wurden nach 6 Tagen Vorkultur mit einer Nadel punktiert und für 2 Tage mit inflammatorischen Faktoren behandelt (LPS, IL1β) bzw. als unbehandelte Kontrollen belassen. Die Induktion einer inflammatorischen Antwort wurde durch Prostaglandin-(PGE2)-Analyse der Medienüberstände und Expressionsanalyse der isolierten Zellen bezüglich inflammatorischer Zytokine, MMPs, Aggrecan und Kollagen Typ II (Koll-2) untersucht. Das Stoffwechselprofil der Organkulturen wurde über den Glucoseverbrauch bestimmt. Zur Simulation normaler oder degenerativer Bedingungen wurde das Kulturmedium auf Normalbedingungen (5mM Glucose, 400 mOsm) oder Nährstoffmangel (0,05 mM Glucose, 300 mOsm) eingestellt. Einem Teil der Bandscheiben wurden fluoreszenz-markierte Bandscheiben-Zellen (PKH-67/26) in einem Albumin-Hydrogel injiziert. Bandscheiben mit injizierten Zellen wurden nach 1, 2 und 4 Wochen Inkubationszeit histomorphologisch und immunhistochemisch analysiert und der Glycosaminoglycan-(GAG)-Gehalt wurde bestimmt.
Ergebnisse: Die PGE2-Konzentration wurde durch Behandlung der Organkulturen mit LPS (10 µg/mL) oder IL1β (10 ng/mL bzw. 100 ng/mL) im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen signifikant erhöht (jeweils 21.7±0.8-fach, 5.5±0.9-fach bzw. 9.6±0.8-fach, n=27, p<0.0001). Erste Ergebnisse zeigten in Zellen, die aus LPS- oder IL1β-behandelten Proben isoliert wurden, eine erhöhte Expression von IL-6, IL-8, MMP-1 and MMP-3 und eine Erniedrigung der Koll-II und Aggrecan-Expression. Der GAG-Gehalt der Proben nahm während 2 Wochen Kulturzeit deutlich ab (62,4 ± 9%). Bezüglich der Glucose-Verbrauchswerte und der Lactat-Produktion zeigten die behandelten Proben ähnliche Werte wie die Kontrollen und lagen oberhalb des kritischen Mangel-Grenzwertes (1mM). Fluoreszierende Zellen konnten zu jedem Zeitpunkt im Gewebe nachgewiesen werden, mit nur geringen Unterschieden zwischen den verschiedenen Kulturbedingungen.
Schlussfolgerung: Durch Simulation degenerativer oder inflammatorischer Umgebungsbedingungen konnten wir in Organkulturen eine PGE2-Erhöhung, eine Expressionserhöhung von MMPs und Interleukinen sowie eine erniedrigte Matrixprotein-Expression induzieren. Der Nachweis injizierter fluoreszenz-markierter Zellen ermöglicht die Charakterisierung der Zellreaktionen unter Simulation einer degenerativen Umgebung. Dieses Modell bietet vielversprechende Möglichkeiten zur In-vitro-Testung regenerativer und anti-inflammatorischer Therapien der Bandscheibendegeneration.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR15-721
doi: 10.3205/14dkou503, urn:nbn:de:0183-14dkou5031
Published: October 13, 2014
© 2014 Neidlinger-Wilke et al.
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/deed.en). You are free: to Share – to copy, distribute and transmit the work, provided the original author and source are credited.
by G. H. | Feb 13, 2019 | Konservative Orthopädie, News
Ergebnisse einer tierexperimentellen Studie zur Behandlung großflächiger Knorpelschäden
Andereya S, Gavenis K, Schneider U
Fragestellung: Die vorliegende tierexperimentelle Studie soll Aufschlüsse darüber geben, ob eine zellbesiedelte komprimierte Kollagengelmatrix zur Behandlung großflächiger Knorpelschäden geeignet ist.
Methodik: Bei 18 Göttinger Minipigs wurden großflächige Knorpelschäden am Kniegelenk mit einer verdichteten dreidimensionalen zellbesiedelten Kollagengelmatrix behandelt und nach 6 Wochen, 3 Monaten und 1 Jahr mit dem unbehandelten Defekt auf der Gegenseite verglichen. Die Untersuchung beinhaltete den makroskopischen und histologischen Vergleich mit Hilfe des O’Driscoll Score sowie immunhistologische Untersuchungen und die Ermittlung der Genexpression mittels PCR.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Weder bei den matrixgedeckten Defekten noch bei der alleinigen Abrasion konnte eine vollständige Defektdeckung im zeitlichen Verlauf beobachtet werden. Alle mit dem komprimierten Kollagengel behandelten Defekte zeigten eine Regeneratbildung. Im zentralen Bereich der Trochlea wurde ein oberflächlicher Abrieb beobachtet. In der Kontrollgruppe zeigte sich ein teilweise ausgedehnter narbiger Defekt. Die histologische Aufarbeitung zeigte für die mit komprimierten Matrizes behandelten Defekte ein homogenes zellreiches Regenerat ohne den typischen zonalen Aufbau hyalinartigen Knorpels. Die Kontrolldefekte zeigten während des Untersuchungszeitraums ein zellarmes faseriges Regenerat mit schweren Fissuren und Vakuolenbildung. Die O’Driscoll Einzelscores und der Gesamtscore lagen im zeitlichen Verlauf für die Abrasion deutlich unter der Kollagengelgruppe. Die Kollagen-II- und Aggrecan-Genexpression lag im Matrixregenerat im Vergleich zum abradierten Kontrolldefekt deutlicher höher. Die Messwerte für die proinflammatorischen Zytokine TNFalpha, IL-1beta, IL-6 und der matrixdestabilisierenden Kollagenase MMP- 13 lagen nach 1 Jahr in der Kontrollgruppe deutlicher höher als in der Gruppe der matrixtransplantierten großflächigen Defekte.
Die Verwendung einer komprimierten zellbesiedelten Kollagengelmatrix zur Behandlung vollschichtiger großflächiger Knorpeldefekte am Tiermodell zeigt im Jahresverlauf erste vielversprechende klinische Ergebnisse im Vergleich zum unbehandelten Spontanverlauf.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR15-1196
doi: 10.3205/14dkou502, urn:nbn:de:0183-14dkou5027
Published: October 13, 2014
© 2014 Andereya et al.
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by G. H. | Feb 13, 2019 | Chirurgische Orthopädie, Konservative Orthopädie, News
Volumetrische Quantifizierung von Knorpelregeneraten mittels Ultraschallbiomikroskopie am Schafsmodell
Schöne M, Männicke N, Marquaß B, Aydogan E, Zscharnack M, Josten C, Schulz R, Raum K
Fragestellung: Zur Beurteilung von Knorpelregeneraten in experimentellen Studien gilt die histologische Untersuchung und Klassifizierung als der derzeitige Goldstandard. Nachteilig ist, dass es sich hierbei um die Beurteilung eines 2D Schnittbildes handelt welches als repräsentativ für den gesamten 3D Defekt gesehen wird. Hier bietet sich die Ultraschallbiomikroskopie (UBM) als additive Untersuchung an, da sie nicht-destruktiv eine 3D Abbildung der gesamten Knorpelschicht ermöglicht. Daraus abgeleitete volumetrische Daten sollten in dieser Studie genutzt werden, um Knorpelregenerate retrospektivisch zu charakterisieren.
Methodik: An 32 Schafen wurde an beiden medialen Femurkondylen je ein vollschichtiger Knorpeldefekt (7 mm Durchmesser) gesetzt. Im Anschluss erfolgte die Versorgung mit einem stammzellbesiedelten Kollagen-I-Hydrogel (Fa. Arthro Kinetics) oder einem unbesiedelten Leergel, die kontralaterale Seite blieb als Kontrolle unbehandelt.
Nach 1- bzw. 2-jähriger Standzeit erfolgte die verblindete Explantation der Kondylen. Nach makroskopischer Beurteilung wurde die Defektregion mit einem portablen UBM (laterale Auflösung 50 µm) gescannt. Die Auswertung der 3D Datensätze erfolgte mit eigens entwickelter Software.
Zunächst wurden die Oberfläche und der Knorpel-Knochenübergang automatisch rekonstruiert, gefolgt von manueller Kontrolle und Korrektur bei Bedarf. Auf Grundlage der rekonstruierten Flächen außerhalb des Defektbereiches wurden die präoperativen Verläufe von Oberfläche und Knorpel-Knochenübergang im Defektbereich abgeschätzt. Anhand der Differenzen zwischen den prä- und postoperativen Grenzflächen wurden Knorpeldicke und die Volumina von entferntem Gewebe, neuem Gewebe, hypertropher Ossifikation, Zysten und neuem knorpelartigem Gewebe berechnet.
An 6 Datensätzen von gesundem Gelenkknorpel wurde die Methode zum Abschätzen der präoperativen Grenzflächen überprüft und deren Genauigkeit quantifiziert.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Der mittlere Fehler aufgrund der Abschätzung der Grenzflächen lag bei 0,6%, die maximale Abweichung bei 1,5%.
Die operierten Schafsproben wiesen eine Knorpeldicke von 0,98 ± 0,29 mm auf. Das entfernte Volumen lag bei 31,6 ± 9,9 mm³, ohne signifikante Unterschiede bezüglich Standzeit und Seite. Die relative Defektfüllung war nach einem Jahr Standzeit mit 64 ± 19% signifikant kleiner als nach zwei Jahren mit 79 ± 11%. Davon blieb der Anteil hypertropher Ossifikation mit 10 ± 12% (Median ± IQR) über beide Jahr unverändert, die Menge des neuen knorpelartigen Gewebes nahm jedoch signifikant zu. Das Volumen von Zysten war nach einem Jahr signifikant größer als nach zwei Jahren (5,9 vs. 2,5 mm³).
Durch die UBM-Daten konnten erstmals Volumendaten zur Knorpelregeneration und Defektsetzung am Großtier gezeigt werden. Aus knorpelregenerativer Sicht ist eine signifikante Zunahme der Defektfüllung zwischen erstem und zweitem Jahr interessant. Die UBM stellt eine sinnvolle Ergänzung zur histologischen Untersuchung dar und übertrifft die Auflösung experimenteller Hochfeld-MRT.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR15-1059
doi: 10.3205/14dkou501, urn:nbn:de:0183-14dkou5011
Published: October 13, 2014
© 2014 Schöne et al.
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by G. H. | Feb 3, 2019 | Fuß, Hüfte + Endoprothetik, Knie + Endoprothetik, News
Die valgisierende Standardkorrektur verbessert die Reparatur fokaler Knorpeldefekte – eine translationale Studie im Schafmodell
Goebel L, Orth P, Müller A, Zurakowski D, Pape D, Kohn DM, Cucchiarini Madry M, Madry H
Fragestellung: Markraumstimulierende Verfahren sind zur Behandlung kleiner symptomatischer Knorpeldefekte indiziert. Der Einfluss der Beinachse auf die Reparatur von fokalen Knorpeldefekten ist jedoch weitgehend unklar. Wir testeten daher die Hypothese, dass die Entlastung vollschichtiger Knorpeldefekte im lasttragenden medialen Femurkondylus durch valgisierende Tibiakopfosteotomien (HTO) zur verbesserten Knorpelreparatur im präklinischen Schafmodell im Vergleich zu einer erhöhten Belastung durch Varisierung führt. Weiterhin wurde die Hypothese getestet, dass eine valgisierende Standardkorrektur zu besseren Ergebnissen als Überkorrektur führt.
Methodik: Bei 19 adulten Merinoschafen wurden bilateral vollschichtige Knorpeldefekte (4 x 8 mm) im medialen Femurkondylus gesetzt und durch Pridiebohrung therapiert. Alle rechten Hinterbeine erhielten eine mediale, biplanare HTO (TomoFix small stature): (a) schließende HTO (5,5° Varus; n=4), (b) öffnende HTO (6,5° Valgus; Standardkorrektur; n=10), (c) öffnende HTO (11,5° Valgus; Überkorrektur; n=5). Linke Hinterbeine dienten als Kontrolle. Postoperativ war Vollbelastung erlaubt. Nach sechs Monaten erfolgten verblindete Analysen per 9,4 Tesla Hochfeld-MRT (µMRT, 2D MOCART Score), makroskopischem Score, Mikrocomputertomographie (µCT), Immunhistochemie für Typ I- und II-Kollagen und Histologie (Sellers Score). Statistische Auswertung unter Anwendung Quasi-Likelihood-Methoden und verallgemeinerter Schätzungsgleichungen (SPSS, Armonk, USA). Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung angegeben mit signifikantem P<0,05.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Makroskopisch führte die valgisierende Standardkorrektur zu verbesserter Farbe (P=0,012), Oberfläche (P<0,001) Defektfüllung (P=0,002) und Gesamtpunktzahl (P=0,019). Im µMRT zeigte sich eine verbesserte Defektfüllung (P<0,001) und MOCART-Gesamtpunktzahl (P=0,034). Histologisch ergab die valgisierende Standardkorrektur beste Werte für Defektfüllung (P<0,001) und Gesamtpunktzahl (P=0,011). Varisierung verschlechterte Zellmorphologie (P=0.016) und Typ-II-Kollagen-Immunfärbung (P<0,001). Die Knochendichte der subchondralen Knochenplatte war im µCT nach Varisierung (P=0,046) und valgisierender Überkorrektur (P=0,001) reduziert.
Eine valgisierende Standardkorrektur führt im translationalen Schafmodell zu signifikant verbesserter makroskopischer und struktureller Knorpelreparatur im medialen Femurkondylus im Vergleich zu den Kontrollen. Eine Überkorrektur sollte vermieden werden. Diese translationalen Ergebnisse unterstützen das Konzept der Entlastung von vollschichtigen Knorpeldefekten in lasttragenden Bereichen des medialen Femurkondylus bei Patienten mit Varusfehlstellung.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR15-1470
doi: 10.3205/14dkou500, urn:nbn:de:0183-14dkou5001
Published: October 13, 2014
© 2014 Goebel et al.
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by G. H. | Feb 3, 2019 | Fuß, Hüfte + Endoprothetik, Knie + Endoprothetik, News
Integration von nativen Knorpelgewebstransplantaten im Schafsmodell
Gelse K, Pachowsky M, Hennig FF, Trattnig S, Welsch G
Fragestellung: Das Ziel dieser Studie bestand darin, in einem Schafsmodell die Integration von nativen Knorpelgewebstransplantaten mit dem umgebenden Gewebe von Knorpeldefekten zu untersuchen. Hintergrund dieser Arbeit sind Beobachtungen neuerer Studien, welche den Chondrozyten prinzipiell die Fähigkeit zur Migration aus der Knorpelmatrix heraus zubilligen, wodurch der Begriff des sogenannten „integrative cartilage repair“ postuliert wurde.
Methodik: In adulten Schafen (n=12) wurden Knorpeldefekte (5 mm Durchmesser) in der medialen Femurcondyle mit 4 unterschiedlichen Reparaturverfahren behandelt (n=6 je Gruppe). In die Defekte wurden 1 mm dicke native Knorpelgewebe-Chips (Transplantate) eingesetzt, die zuvor aus dem Randbereich der Trochlea isoliert wurden. Die subchondrale Knochenlamelle wurde dabei entweder intakt belassen oder mittels je 5 Mikrofrakturierungen penetriert. Als Kontrollen dienten entweder unbehandelte Defekte mit intakter subchondraler Knochenlamelle oder Defekte, die lediglich mit reiner Mikrofrakturierung behandelt wurden.
Die Analyse der Defekte und der Reparaturgewebe erfolgte nach 6 und 26 Wochen mittels histologischer Methoden (ICRS II Score, modifizierter O’Driscoll Score).
Ergebnisse: In diesem Schafsmodell zeigten unbehandelte und mittels Mikrofrakturierung behandelte Defekte eine durchweg inkomplette Defektauffüllung mit minderwertigem Faserknorpel. Beim Einsetzen von nativen Knorpelgewebstransplantaten kam es in 60% (6 Wochen) bzw. 41% (26 Wochen) der Fälle zu einer Delamination bzw. Dislokation der Transplantate. Ursache hierfür war eine insuffiziente laterale Integration mit dem umgebenden Knorpel und eine komplett ausgebliebene basale Integration mit der darunterliegenden kalzifizierten Knorpelschicht. Eine Zellmigration bzw. ein Auswachsen von Chondrozyten aus der Matrix der Transplantate heraus konnte in dieser in vivo- Studie nicht regelhaft nachgewiesen werden. Die Matrix der Transplantate neigte hingegen während der Untersuchungszeiträume zur Degeneration mit erheblichen Proteoglykanverlust.
Im Gegensatz dazu zeigten die Transplantate in Defekten mit arrodierten Knochenmark und entfernter basaler kalzifizierter Knorpelschicht eine signifikant bessere basale und laterale Integration. Die einsprossende Zellen aus dem Knochenmark fungierten offenbar als Defektfüller und trugen zur besseren Integration bei.
Schlussfolgerung: Ein sogenanntes „integrative cartilage repair“ mit spontanem Auswachsen und Migration von Chondrozyten aus nativen Knorpelgewebstransplantaten heraus konnte in diesem Modell nicht regelhaft nachgewiesen werden. Die Integration konnte hingegen durch einwandernde Zellen nach Arrosion des subchondralen Knochenmarks mittels Mikrofrakturierung verbessert werden.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR15-932
doi: 10.3205/14dkou499, urn:nbn:de:0183-14dkou4993
Published: October 13, 2014
© 2014 Gelse et al.
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by G. H. | Feb 3, 2019 | Knie + Endoprothetik, News, Rheumatologie + Osteoporose
Untersuchungen zum immunprivilegierten Status von artikulären Chondrozyten in Knorpeldefekten im Großtiermodell
Niemietz T, Zaß G, Hagmann S, Gotterbarm T, Großner T, Richter W
Fragestellung: Die autologe Chondrozytentransplantation zählt heute zu den Standardtherapien für die Behandlung von Gelenkknorpeldefekten. Da autologe Chondrozyten jedoch nur begrenzt zur Verfügung stehen, wird auch die Verwendung von Knorpelzellen aus allogenen oder xenogenen Quellen diskutiert. In Nordamerika werden allogene Knorpeltransplantationen häufig klinisch eingesetzt, weil in experimentellen Studien meist keine Immunreaktionen gegen implantiertes, körperfremdes Knorpelgewebe sowie allogene Chondrozyten beobachtet wurden. Um zu prüfen, ob humanen Chondrozyten immunprivilegierte Eigenschaften zugesprochen werden können, sollte die vorliegende Studie an einem Großtiermodell überprüfen, ob humane Chondrozyten in Knorpeldefekten des Minischweins persistieren und zum Regenerationswebe beitragen können.
Methodik: Vollschichtige Knorpeldefekte der medialen Femurkondylen von Göttinger Minischweinen wurden durch die Matrix-gekoppelte Implantation von expandierten, humanen, artikulären Chondrozyten oder durch die Implantation von zellfreier Matrix behandelt. Als Trägermaterialen wurden zwei klinisch bereits eingesetzte Hydrogele verwendet. Zwei und vier Wochen nach Behandlung wurden die Defekte auf Anzeichen für Entzündungen, Wirtszelleinwanderung und die Persistenz der implantierten Zellen mittels spezies-spezifischer in situ Hybridisierung untersucht sowie die frühe Defektregeneration dem mit modifiziertem O’Driscoll Score bewertet. Parallel zum Großtiermodell wurden zusätzliche Konstrukte ektop in immunsupprimierte Mäuse implantiert.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Die ektope Implantation belegte die Fähigkeit der verwendeten Chondrozyten in den Hydrogelen in vivo zu Knorpelgewebe zu redifferenzieren. Die Trägermaterialien bewiesen im Großtiermodell eine gute Biokompatibilität ohne signifikante Unterschiede hinsichtlich Wirtszelleinwanderung und zeigten vergleichbare histologische Scores für die frühe Defektregeneration. Bereits zwei Wochen nach der Implantation wurden nur noch wenige humane Chondrozyten nachgewiesen. Die verbliebenen Zellen befanden sich in geschützten Regionen mit geringem Remodelling der subchondralen Platte. Spezifische Färbungen zeigten, dass vor allem Makrophagen mit den humanen Zellen kolokalisiert waren.
Vermutungen zum immunprivilegierten Status von humanen Chondrozyten stützen sich bisher vor allem auf in vitro Versuche. Wir konnten zeigen, dass xenogen implantierte, humane Chondrozyten trotz ihrer Fähigkeit zur erfolgreichen in vivo Redifferenzierung, im orthotopen Großtiermodell nicht persistieren. Die Kolokalisation von Makrophagen und implantierten Chondrozyten legt eine Makrophagen-vermittelte Zellabstoßung nahe. Der erwartete immunprivilegierte Status von humanen, artikulären Knorpelzellen konnte somit im vorliegenden xenogenen Modell nicht belegt werden.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR15-1033
doi: 10.3205/14dkou498, urn:nbn:de:0183-14dkou4981
Published: October 13, 2014
© 2014 Niemietz et al.
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