by G. H. | Dez 3, 2018 | Arthrosetherapie, News
Verbesserte Knochenneubildung durch ein Bioglas-Polymer besiedelt mit osteogen vordifferenzierten stromalen Knochenmarkzellen und frühen endothelialen Vorläuferzellen im critical size Schädelkalottendefektmodell der Ratte
Henrich D, Eldesoqi K, Nau C, Marzi I, Seebach C
Fragestellung: Komposite aus Bioglas (BG) und polylaktischer Säure (PLA) sind vielversprechende Materialien für das Knochen-Tissue Engineering. Gleichfalls ist bekannt, dass stromale Knochenmarkzellen (MSC) und frühe endotheliale Vorläuferzellen (EPC) in Kombination mit Knochenersatzmaterialien die Knochenneubildung signifikant verbessern und das osteogen vordifferenzierte MSC zu einer verbesserten Knochenneubildung führen können. Jedoch ist nur wenig bekannt, ob MSC und EPC auf derartigen Kompositmaterialien adhärieren und in vivo die Knochenneubildung unterstützen. Daher untersuchten wir in der vorliegenden Studie die Adhäsion von MSC, osteogen differenzierten MSC (dMSC) und EPC auf Kompositen mit steigendem BG-Gehalt (Korngröße 106-125 µm) in vitro sowie den Effekt auf die Knochenneubildung im Schädelkalottendefektmodell der Ratte in vivo.
Methodik: Die Studie wurde durch die lokale Tierversuchskommission genehmigt. MSC wurden aus Rattenfemur, EPC aus Rattenmilzen isoliert und nach Standardprotokollen kultiviert. Osteogene Differenzierung erfolgte über 3 Wochen nach Standardprotokollen. MSC+EPC, bzw. dMSC+EPC wurden auf PLA, PLA+20%BG (BG20), sowie PLA+40%BG (BG40) ausgesät. Adhäsion (2 h nach Aussaat) sowie Vitalität (24h nach Aussaat) wurden semiquantitativ fluoreszenzmikroskopisch evaluiert. Gleiche Ansätze wurden in ein Schädelkalottendefektmodell an männlichen SD-Ratten (6 mm Durchmesser, n=8-10/Gruppe) implantiert. Nach 14 Wochen wurden die Schädel histologisch aufgearbeitet. Evaluation der Knochenneubildung erfolgte histomorphometrisch an HE-gefärbten Schnittpräparaten (% Knochengewebe). Statistik: ANOVA + posthoc-Analyse, Bonferroni-korrigiertes p<0.05 ist signifikant.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: In vitro: Es bestanden keine signifikanten Unterschiede bezüglich der Adhäsion und Vitalität von MSC, dMSC und EPC zwischen den Testmaterialien. In vivo: Weder Infektion noch verzögerte Wundheilung wurden beobachtet. Im Vergleich zum leeren Defekt (11%) war die Knochenneubildung bei Verwendung von PLA (24%) und BG20 (30%) im Trend, gegenüber BG40 signifikant erhöht (39%). Bei Verwendung osteogen vordifferenzierter MSC konnte eine weitere Steigerung der Knochenneubildung verzeichnet werden (PLA:34%, BG20:42%, BG40:49%). Insbesondere in der BG40-Gruppe konnte häufig eine durchgehende knöchernde Durchbauung des Defekts beobachtet werden.
Es konnte gezeigt werden, dass Komposite aus Bioglas für die aufgebrachten Zellen verträglich sind, dass die Knochenneubildung mit steigendem BG-Anteil zunimmt und dass eine osteogene Vordifferenzierung der MSC die Knochenneubildung über den Bioglaseffekt hinaus weiter befördern kann. Frühere Analysen zeigten, dass insbesonders aus dem Bioglasanteil freigesetzte Calcium-Ionen zellprotektive Effekte auf EPC ausüben (eigene Daten) sowie die osteogene Kapazität von MSC verbessern. Es ist daher zu vermuten, dass dieser Effekt zu der verbesserten Knochenneubildung bei Verwendung von BG40 beigetragen hat.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR13-679
doi: 10.3205/14dkou484, urn:nbn:de:0183-14dkou4845
Published: October 13, 2014
© 2014 Henrich et al.
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by G. H. | Dez 3, 2018 | Arthrosetherapie, News
Vergleich des Potenzials autogener und allogener mesechymaler Stammzellen zur Regenration von Knochendefekten im Mausmodell
Rapp A, Bindl R, Erbacher A, Kemmler J, Müller I, Rojewski M, Schrezenmeier H, Ignatius A
Fragestellung: Durch ihres hohen Regenerationspotenzials und ihrer geringen Immunogenität stellen mesenchymale Stammzellen ein vielversprechendes Werkzeug für die Behandlung von Knochendefekten dar. Während der Nutzen autogener Stammzellen für die Knochenregeneration anerkannt ist (Kon et al. 2000, Hernigou et al. 2005), ist die Nutzbarkeit allogener Zellen weniger untersucht. Kürzlich wurde in einer experimentellen Studie eine gleichwertige Knochenbildung nach Verwendung autogener und allogener MSC berichtet (Berner et al. 2013). In anderen Ansätzen wurde jedoch eine geringere Wirkung der allogenen MSC auf die Knochenbildung beschrieben (Niemeyer et al. 2010). Da die Nutzung allogener MSC die größten Nachteile autogener Zellen wie limitierte Verfügbarkeit und langwierige Expansion beheben würde, sind weitere Untersuchungen zur Nutzbarkeit allogener MSC nötig. In dieser Studie vergleichen wir das Potenzial autogener und allogener MSC zur Regeneration von Knochendefekten in einem humanisierten Maus-Modell.
Methodik: Um eine Maus mit humanisiertem Immunsystem zu generieren wurden NOD/scid-Il2Rγ 0-Mäuse sublethal bestrahlt und mit humanen hämatopoetischen Stammzellen behandelt. Nach der Rekonstitution des Immunsystems wurde ein 1 mm Defekt im rechten Femur geschaffen und mit einem Fixateur externe stabilisiert. Der Defekt wurde mit autogenen oder allogenen MSC in einer Kollagenmatrix oder nur Kollagen gefüllt. Die Tiere wurden nach 10 oder 35 Tagen getötet. Die Heilung wurde mittels μCT und Histomorphometrie untersucht. Die Anwesenheit der transplantierten Zellen wurde durch Färbung von humanem β2-Microglobulin untersucht, zudem wurden humane CD8+-T-Zellen, CD31 und Runx2 mittels Immunfärbung nachgewiesen.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Die transplantierten Zellen konnten an Tag 10 und 35 durch Färbung des humanen β2-Microglobulins in Defekten der autogenen und allogenen Behandlungsgruppe nachgewiesen werden. Im μCT wurde ein signifikant höherer Knochenanteil am Kallusvolumen (BV/TV) in der autogenen Gruppe im Vergleich zur allogenen (+129%) oder zellfreien (+127%) Gruppe detektiert. Dies wurde durch histomorphometrische Analysen bestätigt. Die Färbung von CD8 deutete in keiner der Behandlungsgruppen auf eine gegen das Implantat gerichtete Immunreaktion hin. Die Färbung von CD31 zeigte mehr gefärbte Zellen in Defekten der autogen behandelten Tiere. Die Färbung von Runx2 fiel in der autogen behandelten Gruppe stärker aus.
Unsere Ergebnisse deuten auf eine bessere Eignung autologer MSC zur Behandlung von Knochendefekten hin. Im Vergleich mit allogenen MSC oder zellfreiem Kollagen resultierte die Behandlung mit autogenen MSC in einem signifikant höheren Kochenanteil im Defekt. Wir konnten in keiner Gruppe eine gegen das Implantat gerichtete Immunreaktion detektieren. Färbungen osteogener und angiogener Marker zeigten eine stärkere Expression in der autogen behandelten Gruppe. Die legt den Schluss nahe, dass autogene MSC die Knochenformation über eine gesteigerte Angiogenese und Osteogenese begünstigen.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR13-606
doi: 10.3205/14dkou483, urn:nbn:de:0183-14dkou4831
Published: October 13, 2014
© 2014 Rapp et al.
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by G. H. | Nov 26, 2018 | Arthrosetherapie, News
ROBUST-Regeneration of osteoporotic bone using stem cell transplantation
Saxer F, Studer P, Miot S, Todorov A, Schaefer D, Martin I, Scherberich A, Jakob M
Fragestellung: Ist die Nutzung nicht-expandierter undifferenzierter Zellen der stromal vaskulären Fraktion (SVF) des menschlichen Fettgewebes als zelluläre Komponente eines Composite-Grafts zur biologisch aktiven Augmentation von Knochendefekten und Frakturen im Tiermodell bzw. der Klinik möglich?
Methodik: SVF Zellen wurden aus dem Fett menschlicher Spender nach Enzymverdau anhand des Dichtegradienten isoliert. Sie wurden mittels Fibrin Gel auf Hydroxyapatit-Träger (Actifuse, Baxter, USA) aufgebracht und in Femurdefekte kritischer Grösse athymer Ratten (Crl:NIH-Foxn1mu, Charles River, Deutschland) implantiert, die mittels RatFix System (RISystem AG, Schweiz) stabilisiert wurde. Nach 8 Wochen in vivo wurden die Femora entnommen und histologisch, sowie biomechanisch untersucht. Im Rahmen einer Sicherheits- und Machbarkeitsstudie erfolgte die Translation des Ansatzes. Patienten mit Indikation zur offenen Reposition und Osteosynthese einer osteoporotischen proximalen Humerusfraktur wurden bei entsprechender Einwilligung und Eignung ca. 300 ml Fett per Liposuction entnommen. Aus dem Aspirat wurde im Cellution800/CRS (Cytori, USA) die SVF isoliert und nach o.g. Prinzip zur Zellularisierung eines Grafts genutzt, mit dem die Fraktur augmentiert wurde. Protokolldeviationen und Komplikationen wurden dokumentiert. Im Fall einer Implantatentfernung wurde eine Biopsie entnommen. Die implantierten Zellen wurden im Tiermodell und der klinischen Studie anhand ihrer Oberflächenmarker und Klonogenität charakterisiert.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Im Tiermodell konnte in 2/3 der Behandlungsgruppe das Auftreten von Knochen und Gefässen humanen Ursprungs nachgewiesen werden. In 1/3 der Fälle wurde eine Torsionsstabilität ähnlich der physiologischer Rattenfemora nachgewiesen. Nach Implantation zellfreier Grafts traten instabile Pseudarthrosen ohne histologischen Knochennachweis auf. 6 Patienten wurden bisher in die klinische Studie eingeschlossen. Grobe Protokoll-Deviationen oder prozesstechnische Schwierigkeiten gab es nicht. Die Patienten tolerierten den Zusatzeingriff gut. Durchschnittlich wurden 137 Mio Zellen (32-220 Mio) implantiert. Bei 3 Patienten kam es zu relevanten Komplikationen, die nicht auf die Implantation des Grafts zurückzuführen waren. In zwei bereits entnommenen Biopsien nach 6 bzw. 32 Wochen fand sich Osteoid bzw. Knochen im Graft. Die isolierten Zellen zeigten eine durchschnittliche Klonogenität um 10% mit osteogenem Potenzial in 1/3. 60% exprimierten mesenchymale Marker, 10% endotheliale, deren Proportionen jedoch ohne erkennbaren Einfluss auf das klinische Ergebnis waren.
Dieser einzeitige Ansatz zur Herstellung eines osteo- und vaskulogen aktiven Grafts ist in der klinischen Anwendung sicher und machbar. Er umgeht die Morbidität eines autologen Knochengrafts, sowie bei Osteoporose die Dysfunktionalität der darin enthaltenen Stammzellen. Zudem fördert er die Vaskularisierung des Gewebes. Insgesamt handelt es sich insofern um eine vielversprechende Technik, deren Effektivität zu beweisen wäre.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR13-481
doi: 10.3205/14dkou482, urn:nbn:de:0183-14dkou4821
Published: October 13, 2014
© 2014 Saxer et al.
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by G. H. | Nov 26, 2018 | Arthrosetherapie, News
Die Etablierung eines Infektpseudarthrose-Modells an der Ratte
Helbig L, Rosenberger S, Becker S, Ivanova A, Moghaddam-Alvandi A, Schmidmaier G
Fragestellung: Die Behandlung nicht heilender Knochendefekte, insbesondere bei einer infektionsbedingt verzögerten Knochenbruchheilung, stellt nach wie vor eine große Herausforderung für die Orthopädie und Unfallchirurgie dar. Die Inzidenz von Infektionen nach komplexen Frakturen ist hoch. Insbesondere bei offenen Frakturen mit großem Weichteilschaden entwickeln Patienten nicht selten infektbedingte Pseudarthrosen. Das Ziel dieser Studie ist, ein Tiermodell zu etablieren, mit dem Therapiekonzepte zur Behandlung einer infektionsbedingt verzögerten Knochenbruchheilung in vivo untersucht werden können.
Methodik: Bei 20 Ratten wurde die rechte Tibia mit einer Frakturmaschine frakturiert und im Anschluss mit einem intramedullären K-Draht osteosynthetisch versorgt. Nach Randomisierung wurden 10 Tiere mit einem Staph. aureus Stamm (1000 CFU) vor Implantation des K-Drahtes intramedullär infiziert. Während der Standzeit von 4 Wochen wurden die laborchemischen Infektparameter, das Gewicht und die Körpertemperatur regelmäßig bestimmt. Nach 4 Wochen erfolgten die biomechanische Torsionsmessung als Maß für die knöcherne Konsolidierung, sowie eine mikrobiologische Untersuchung des entfernten K-Drahtes. Außerdem wurde eine µCT-Unteruchung der Frakturregion durchgeführt und mit Hilfe des modifizierten Lane Sandhu Scores ausgewertet.
Ergebnisse: Die laborchemischen Infektparameter, das Körpergewicht und die Körpertemperatur lagen für alle Tiere über den gesamten Verlauf im Normbereich bzw. haben sich nicht signifikant verändert. Bei allen infizierten Tieren konnte in der Mikrobiologie der Staph. aureus Stamm nachgewiesen werden. Die nicht infizierten Tiere waren mikrobiologisch blande. Die biomechanische Torsionsmessung ergab bei den infizierten Tieren signifikant (p<0,05) geringere maximale Torsionswerte (Durchschnittswert: 0,06 Nm) als bei den nicht infizierten Tieren (0,13 Nm). Die µCT-Unteruchung ergab im modifizierten Lane Sandhu Score bei den infizierten Tieren signifikant (p<0,05) schlechtere Scorewerte (Median: 1) als bei den nichtinfizierten Tieren (Median: 4).
Schlussfolgerung: Im Rahmen der Studie konnte das beschriebene Infektpseudarthrose-Modell an der Ratte etabliert werden. Unsere Ergebnisse zeigen, dass das Modell geeignet ist, in weiterführenden Studien verschiedene Therapieansätze in der Behandlung der Infektpseudarthrose zu überprüfen.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR13-850
doi: 10.3205/14dkou481, urn:nbn:de:0183-14dkou4811
Published: October 13, 2014
© 2014 Helbig et al.
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by G. H. | Nov 26, 2018 | Arthrosetherapie, News
Analyse der Heilungsverläufe bei Femurpseudarthrosen mit einem instrumentierten Implantat
Riha T, Kowald B, Münch M, Seide K, Jürgens C, Faschingbauer M
Fragestellung: Heilungsverläufe nach Pseudarthrosen sind sehr unterschiedlich. Röntgenbilder ermöglichen ausschließlich eine Aussage über die Kalzifizierung. Telemetrisch instrumentierte (intelligente) Implantate bieten eine Möglichkeit des quantitativen Monitorings der mechanischen Konsolidierung. Ziel der Studie war die Suche nach Parametern zur Klassifizierung der Heilungskurven und deren Analyse.
Methodik: Das System besteht aus einer winkelstabilen Platte, auf die eine Elektronikeinheit zur Messung der Biegelast im Implantat aufgebracht wird, einem externen Lesegerät und einem Bodensensor zur Messung von extern applizierter Last. Durch Korrelation extern auf die Extremität aufgebrachter Lasten mit der Last im Implantat wird die Elastizität der Osteosynthese bestimmt. Diese nimmt mit zunehmender Konsolidierung der Pseudarthrose ab und ist geeignet den Verlauf der Knochenheilung zu quantifizieren.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Die Anwendung bei Femurpseudarthrosen erfolgte in 35 Fällen. Es ließen sich 4 Heilungstypen differenzieren. 10 schnell heilende Patienten zeigten einen steilen Abfall der Elastizität nach zirka 12 Wochen. 18 langsam heilende Patienten zeigten einen geringen jedoch kontinuierlichen Abfall der Elastizität über bis zu 74 Monate, danach letztlich die knöcherne Konsolidierung. In 5 Fällen war die Elastizität der Osteosynthese über längere Zeit im Sinne eines Plateaus konstant, um dann im späteren Verlauf schnell auf niedrige Werte abzufallen. Ein weiterer Typ (2 Patienten) entsprach nahezu konstant bleibenden Werten über 40 Wochen im Sinne einer ausbleibenden Konsolidierung, wobei die Behandlung noch nicht abgeschlossen ist. Die gemessene Anfangselastizität der Osteosynthese in der Gruppe der langsam heilenden Patienten war signifikant um den Faktor 1,6 höher (p=0,020) als in der Gruppe der schnell heilenden Patienten.
Mit dem Intelligenten Implantat war es möglich, Heilungsverläufe von Femurpseudarthrosen kontinuierlich zu kontrollieren, verschiedene Typen von Verläufen zu differenzieren und somit Patient und Arzt optimale über das CT hinausgehende Entscheidungsgrundlagen zu geben.Die primäre Stabilität der Reosteosynthese beeinflußt signifikant den Heilungsverlauf.Die Definition einer erneuten Pseudarthrose über einen festen Zeitpunkt von 6 oder 8 Monaten ist zu überdenken.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR13-575
doi: 10.3205/14dkou480, urn:nbn:de:0183-14dkou4802
Published: October 13, 2014
© 2014 Riha et al.
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by G. H. | Nov 20, 2018 | Arthrosetherapie, News
Erhöhtes angiogenes Potenzial von GDF-5 und einer GDF-5 Mutante gegenüber BMP-2 bei der Regeneration von Röhrenknochendefekten im Kaninchen
Kleinschmidt K, Wagner-Ecker M, Bartek B, Holschbach J, Rütze M, Richter W
Fragestellung: Die Verwendung von Knochenersatzmaterialien zur Applikation von Wachstumsfaktoren, vor allem aus der Familie der bone morphogenetic proteins (BMPs) hat sich für die Stimulation der Knochenneubildung bewährt. Die Nachverfolgung von Neoangiogenese im Heilungsverlauf beim Einsatz dieser Faktoren wird aber aufgrund der hohen Röntgendichte erschwert. In einer kürzlich veröffentlichten Studie konnte gezeigt werden, dass eine Mutante des pro-angiogenen Wachstumsfaktors growth/differentiation factor 5 (GDF-5) mit neu erworbener BMP1A-Rezeptor Affinität (BB-1) zu einer Stimulation der Knochenneubildung in langen Röhrenknochendefekten des Kaninchens führt, die dem klinischen Standard BMP-2 überlegen ist (Biomaterials 2013, 24:5926-36). Da BB-1 im Vergleich zur BMP-2 Behandlung eine erhöhte Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Sekretion induzierte, war es naheliegend, dass BB-1 pro-angiogene Eigenschaften von GDF-5 mit verbesserten osteogenen Eigenschaften vereint. Ziel der vorliegenden Studie war die quantitative Untersuchung der Neoangiogenese im Tiermodell zu frühen Zeitpunkten nach Behandlung mit BMP-2, GDF-5 und BB-1.
Methodik: Am Radius von Kaninchen (n=44) wurde ein 15 mm langer Knochendefekt gesetzt, in den ein Kollagenschwamm mit 50 μg BMP-2, GDF-5 oder einer GDF-5 Mutante (BB-1) eingebracht wurde. Kontrolltiere erhielten nur den Träger. Nach 7 und 14 Tagen Standzeit erfolgte die Auswertung der Knochenneubildung mittels in vivo μ-CT sowie, nach in vivo Perfusion der Gefäße mit Kontrastmittel, anschließender Knochenexplantation und Dekalzifizierung eine ex vivo μ-CT Angiographie.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Die Vorgehensweise ermöglichte die Visualisierung und Quantifizierung der Vaskularisierung in hoher Auflösung. Sieben Tage nach Wachstumsfaktor-Applikation zeigten nur die mit BB-1 und GDF-5 behandelten Defekte eine signifikant höhere Neoangiogenese gegenüber Kontrolltieren. Am Tag 14 wurde diese für alle Wachstumsfaktoren deutlich. Die kumulative Auswertung erbrachte für das Gefäßvolumen einen signifikanten Vorteil von GDF-5 (3,8-fach, p=0,049) sowie BB-1 (3,9-fach, P=0,007) gegenüber BMP-2. Jeder der Wachstumsfaktoren zeigte nach 14 Tagen signifikant mehr neues Knochenvolumen gegenüber der Kontrollgruppe (p<0,01). Die durch BB-1 induzierte Knochenneubildung war signifikant erhöht gegenüber GDF-5 (p<0,01).
Zusammengefasst stimulierten die Wachstumsfaktoren nachhaltig die Neoangiogenese während der Knochenneubildung. Im Vergleich zu BMP-2 wird dieser Effekt bei BB-1 und GDF-5 früher deutlich. Nur BB-1 verbindet die Vorteile einer frühen Neoangiogenese mit einer ausgeprägten Stimulation der Osteogenese die in einer besseren Knochenarchitektur resultiert. Aus diesem Grund stellt die Applikation von BB-1 einen vielversprechenden Ansatz zur Heilung von Röhrenknochendefekten kritischer Größe dar.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR12-704
doi: 10.3205/14dkou479, urn:nbn:de:0183-14dkou4797
Published: October 13, 2014
© 2014 Kleinschmidt et al.
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