Chondrogene Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen auf Kollagen I-Gelkonstrukten mittels Gentransfers von SOX-9, TGF-beta1 und BMP-2
Weißenberger M, Kunz M, Nöth U, Reboredo J, Rudert M, Steinert A
Fragestellung: Gentransfer stellt eine effiziente und elegante Verteilungsmethode dar, durch die chondrogene Faktoren an den Ort des Knorpeldefektes in vivo gebracht werden können. In Vorversuchen konnte bereits gezeigt werden, dass adenoviral-vermittelter Gentransfer von SOX-9, TGF-beta1 und BMP-2 die Chondrogenese in Aggregaten von primären mesenchymalen Stammzellen (MSZ) in vitro und in vivo induzieren kann. Diese Studie untersucht daher die Wirkung der adenoviral übertragenen Faktoren SOX-9, TGF-beta1 und BMP-2 auf die chondrogene Differenzierung von MSZ auf Kollagen I-Gelkonstrukten.
Methodik: Humane, adulte MSZ aus dem Knochenmark wurden nach adhärenter Kultur mit den durch Cre/loxP-Rekombination hergestellten, adenoviralen Vektoren für GFP, SOX-9, TGF-beta1 und BMP-2 mit einer MOI (multiplicity of infection) von 50 transduziert und für 3 Wochen auf Kollagen I-Hydrogelen und in chondrogenem Differenzierungsmedium (ITS/Dexamethason/Ascorbat) kultiviert. Nicht-transduzierte und GFP-transduzierte Kulturen dienten als Kontrolle. Die Auswertung der Transgenexpression über den Zeitverlauf erfolgte für die Transgene GFP und SOX-9 mittels Fluoreszenzmikroskopie, für TGF-beta1 und BMP-2 mittels ELISA. An Tag 21 wurden die Chondrogenese- und Hypertrophiestadien der Gelkonstrukte durch (immun-)histologische Färbungen sowie quantitative RT-PCR und über den Zeitverlauf quantitativ biochemisch untersucht.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Es konnte durch diese in-vitro-Arbeit gezeigt werden, dass MSZ auf Kollagen I-Gelen durch die Transgene SOX-9, TGF-beta1 und BMP-2 chondrogen differenziert werden können, was qualitativ in der Alcianblau- und Kollagen II-Färbung und quantitativ in der signifikant gesteigerten Synthese von Glykosaminoglykanen (GAG) im GAG-Assay ersichtlich wurde. Diese Ergebnisse konnten auch auf molekularbiologischer Ebene durch eine signifikante Hochregulation knorpelspezifischer Markergene in quantitativen RT-PCR-Analysen (Kollagen II, SOX-9) bestätigt werden. Die Kontrollgruppen waren in diesem System stets nicht chondrogen. Dabei zeigten die mit TGF-beta1 und BMP-2 transduzierten Gelkonstrukte mehr hypertrophe Merkmale im Vergleich zur SOX-9-Gruppe, sowohl in den biochemischen Untersuchungen (Alkalische Phosphatase) und immunhistochemischen Färbungen (Alkalische Phosphatase, Kollagen X) als auch in den quantitativen RT-PCR-Analysen (Alkalische Phosphatase, Kollagen X). Durch Gentransfer von SOX-9, TGF-beta1 und BMP-2 konnten MSZ auf Kollagen I-Gelen erfolgreich chondrogen differenziert werden. Somit könnten in Zukunft genetisch modifizierte Kollagen I-Hydrogele bei der Erzeugung von langzeitstabilem, hyalinem Knorpelgewebe in vivo als eine effektive Methode für die Knorpelregeneration angewandt werden.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocSA33-199
doi: 10.3205/14dkou576, urn:nbn:de:0183-14dkou5766
Published: October 13, 2014
© 2014 Weißenberger et al.
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