by R-Dorotka | Apr 15, 2019 | Chirurgische Orthopädie, Konservative Orthopädie, News
Keramisches Scaffold für den osteochondralen Ersatz am Kniegelenk
Mayr HO, Bernstein A, Südkamp NP
Fragestellung: Ziel der Studie ist die Testung eines mit Chondrozyten besiedelten mikroporösen Scaffolds auf beta-Tricalciumphosphatbasis, für das Tissue Engineering bei osteochondralen Defekten in der Tierstudie
Methodik: Als Implantate dienten zylindrische beta-Trialciumphosphat (TCP)-Formkörper mit 7 Durchmesser und 25 mm Länge. Diese offenporigen 3D-beta-Trialciumphosphat-Scaffolds (Mikroporen 5 µm, Porosität 40%, axiale Versagenslast 7200 N/cm²) wurden mit autologen Knorpelzellen in vitro beimpft und für 4 Wochen kultiviert. Die Implantate wurden in geschaffene Defekte (Durchmesser 7 mm) im medialen Femurkondylus des Schafsknies eingebracht. Das Implantat wurde mit Synovialmembran gelenkseitig abgedeckt. Beim rechten Knie diente ein Leerloch gleicher Maße als Kontrolle. 28 Schafe wurden in 6-, 12-, 26- und 52-Wochengruppen zu je 7 Tieren aufgeteilt. Im biomechanischen Indentationsversuch wurde die Eindringprüfung mit einem kugelförmigen (Ø 3 mm) Eindringkörper Weg-geregelt (200 Mikrometer). Es wurde die erreichte Kraft, die absorbierte Energie und die Kontaktsteifigkeit gemessen. Die unentkalkten Knochenproben wurden in Trenn-Dünnschliff-Technik zu histologischen Präparaten verarbeitet. Es wurde eine Beurteilung des neugebildeten Knorpels nach dem ICRS Score und eine histomorphometrische Analyse vorgenommen. Statistische Analyse: T-Test, Mann-Whitney-U-Test, Wilcoxon-Test mit statistischer Signifikanz p<0.05.
Ergebnisse: Im Indentationsversuch tolerierte der transplantierte Bereich eine Kraft von 0.05 ±0.23 N, nach 12 Wochen 0.12 ±0.07 N, nach 26 Wochen 0.24 ±0.23 N und nach 52 Wochen 0.27 ±0.11 N versus 0.30 ±0.12 N beim gesunden Knorpel. Die Zunahme der tolerierten Kraft war hochsignifikant (p<0.0001). Ebenso nahm die Kontaktsteifigkeit von 0.87 ±0.29 N/mm nach 6 Wochen auf 3.14 ±0.86 N/mm nach 52 Wochen mit hochsignifikanter Steigerung (p<0.0001) zu. Die absorbierte Energie stieg signifikant (p= 0.02) von 0.74 ±0.38 mNmm nach 6 Wochen auf 2.82 ±1.35 mNmm nach 52 Wochen. In der ICRS Visual Histological Assessment Scale (max. 18 Punkte) erreichte der Randbereich des transplantierten Areals nach 6 Wochen 7 Punkte und nach 52 Wochen 16 Punkte. Dagegen stagnierte das Zentrum des Transplantationsareales bei 6 Punkten. Die histomorphometrische Beurteilung ergab, dass nach 6 Wochen 1.27±1.89% des TCP resorbiert und knöchern ersetzt waren. Nach 6 Wochen waren es 1.27±1.89%, nach 12 Wochen 23.66±6.34%, nach 26 Wochen 71.60±20.84% und nach 52 Wochen 76.06±18.05%. Die Zunahme der Resorption und des knöchernen Ersatzes über den Beobachtungszeitraum war hochsignifikant (p<0.001).
Schlussfolgerung: In der Schafstudie ähneln die biomechanischen Eigenschaften des Regenerates auf TCP nach 52 Wochen denen des natürlichen Knorpels. Im ICRS-Score wird nicht das morphologische Bild des gesunden Knorpels erreicht. Das TCP als knöcherner Ersatz wird resorbiert und knöchern ersetzt.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR18-275
doi: 10.3205/14dkou528, urn:nbn:de:0183-14dkou5285
Published: October 13, 2014
© 2014 Mayr et al.
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/deed.en). You are free: to Share – to copy, distribute and transmit the work, provided the original author and source are credited.
by R-Dorotka | Apr 15, 2019 | Chirurgische Orthopädie, Konservative Orthopädie, News
BMP-2 Release aus mikroporösen beta-TCP Scaffolds mit Alginat als Carrier
Kißling S, Seidenstuecker M, Mayr HO, Südkamp NP, Bernstein A
Fragestellung: Bone Morphogenetic Protein-2 (BMP-2) führt zu gesteigerter Knochenneubildung. Die osteoinduktive Potenz von BMP-2 ist höher, wenn es in einen Träger eingebaut ist. Beta Tricalciumphosphat (beta-TCP) hat sich als geeignetes Material hinsichtlich Bioabbaubarkeit und mechanischer Stabilität erwiesen. Es ist bisher nicht gelungen, eine kontrollierte Freisetzungskinetik von BMP aus TCP-Scaffolds zu erzielen.
Das Ziel dieser Forschungsarbeit ist, eine definierte Freisetzung von BMP-2 über einen längeren Zeitraum durch Koppelung an ein Hydrogel zu erreichen und somit die Entwicklung eines osteoinduktiven, mechanisch stabilen Scaffolds.
Methodik: Als Modellsubstanz für BMP-2 wurde zunächst FITC-markiertes Protein A (2 mg/ml) verwendet. Für die Beladung der beta-TCP Zylinder (n=8; 40% Porosität, 5 μm Porendurchmesser, interkonnektierend, 7mm x 6 mm) wurden drei verschiedene Hydrogele verwendet und die Freisetzung miteinander verglichen: Gelatine, homogenes Alginatgel und inhomogen ausgehärtetes Alginat. Nach definierten Zeitpunkten (1, 2, 3, 6, 9, 14, 28 Tage) wurde freigesetzte Menge FITC-Protein A bestimmt. Anschließend wurde der Versuch mit dem inhomogen verfestigten Alginat und BMP-2 wiederholt. Weiter wurden beta-TCP-Scaffolds mit der Kombination BMP-2 (0,05 mg/ml) und Alginat (5% w/v) beladen und mit Osteoblast-like-cells (MG63) in Kontakt gebracht. Nach 24h, 48h und 96h wurde ein Live-Dead-Assay zur Beurteilung der Zellvitalität und der WST-1-Test zur Analyse der Viabilität durchgeführt.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Die Abgabe des FITC-Protein A erfolgte sowohl aus der Gelatine, als auch dem homogenen Alginat sehr schnell. So waren bereits nach 24h 80,9% aus der Gelatine und 76,1% aus dem homogenen Alginat freigesetzt.
Das Release aus dem inhomogenen Alginat betrug nach 24h lediglich 36% der Gesamtmenge. Das BMP-2-Release betrug am Tag 14 des Versuchs 257,33 ± 73,19 ng/ml (~11,1%) sowie an Tag 28 des Release-Versuchs 57,56 ± 18,78 ng/ml (~1,82%).
Nach dem Freisetzungsversuch wurden die Scaffolds aufgebrochen und mikroskopiert. Dabei zeigten sich nach 28 Tagen noch deutliche Überreste des FITC-Protein A.
Mit dem Live-Dead-Assay konnte nachgewiesen werden, dass die freigesetzte Menge BMP-2 nicht toxisch ist. Die Zellen wuchsen in das Alginat des beladenen Knochenersatzdübels hinein.
Der WST-1-Test zeigt einen signifikanten Unterschied der Zellviabilität bei Inkubation mit einem BMP-2 und Alginat beladenen Scaffold im Vergleich zu einem lediglich mit Alginat beladenen Scaffold. Dies belegt eine deutliche Proliferationssteigerung.Aufgrund der höheren physikalischen Löslichkeit ist bei dem homogenen Alginatgel und der Gelatine ein deutlicher Burstrelease zu verzeichnen. Das Release aus dem festeren inhomogenen Alginat ist deutlich konstanter.
Osteoblast-like-cells zeigten in Kombination mit den BMP-2 beladenen beta-TCP-Scaffolds eine signifikant erhöhte Proliferation, sowie gute Vitalität.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR18-1140
doi: 10.3205/14dkou527, urn:nbn:de:0183-14dkou5276
Published: October 13, 2014
© 2014 Kißling et al.
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/deed.en). You are free: to Share – to copy, distribute and transmit the work, provided the original author and source are credited.
by R-Dorotka | Apr 15, 2019 | Chirurgische Orthopädie, Konservative Orthopädie, News
Biomechanische Stimulation von Osteoblasten und mesenchymalen Stammzellen auf 3D-Nanostrukturen
Maheswaran V, Özdemir B, Plettl A, Brenner R, Fiedler J
Fragestellung: Der Einfluss nanoskaliger Strukturen auf die Osseointegration von Biomaterialien nimmt bei der Implantatentwicklung eine zentrale Rolle ein. In vorherigen Arbeiten konnten wir die Effekte verschiedener, starrer Nanostrukturen auf humane mesenchymale Stammzellen und Osteoblasten zeigen. Aufbauend auf diese Arbeiten haben wir die Untersuchung der Zell-Biomaterial-Wechselwirkung erweitert, indem ein neuartiges System zur biomechanischen Stimulation der Zellen auf SiO2 basierten dreidimensionalen Trägermaterialien etabliert wurde.
Methodik: Humane Osteoblasten (Ob) und mesenchymale Stammzellen (MSC) wurden aus Restgewebe von Total-Endoprothese-Operationen isoliert. Eine biomechanische Stimulation der Zellen auf 3D-Nanostrukturen erfolgte durch eine neuartige, selbstentwickelte Apparatur.
Mit dieser neuen Methode wurden biegeelastische nanolithotopographisch hergestellte dreidimensionale SiO2-Oberflächen (Abbildung 1 A [Abb. 1]) mit einer Höhe von 100 nm, einem Durchmesser von 10-30 nm und einem Säulenabstand von 100 nm mit Ob und MSC besiedelt und je für 30 min in 24 h zyklisch (Frequenz: 1 Hz) gebeugt. (Abbildung 1 B und C [Abb. 1]) Analysiert wurden die Genexpression osteogener und apoptotischer Markergene mittels quantitativer RT-PCR, sowie die Auswirkung der biomechanischen Stimulation auf das Zytoskelett über immunhistologische Färbungen von Aktin, Vinculin und Vimentin. Eine Statistische Auswertung erfolgte mittels Varianzanalyse (ANOVA).
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Die entwickelte Apparatur erlaubte die sterile Kultivierung der Zellen über den gesamten Testzeitraum von 48h. Im Vergleich zu den bisher untersuchten nanostrukturierten Substraten gab es bezüglich der Zelladhäsion keine Unterschiede, d.h. alle Zellen adhärierten auch auf den eingesetzten dreidimensionalen SiO2-Membranen. Nach der biomechanischen Stimulation zeigten die Zellen weiterhin Adhärenz auf dem Trägermaterial, wobei Zell-morphologische Unterschiede im Vergleich zu nicht stimulierten Oberflächen sichtbar wurden. Daraus ist zu Folgern, dass die geringen, im 1 nm Bereich liegenden Änderungen der Säulen-Abstände zur Modulation der Zell-Antwort führten. Dieser Einfluss konnte auch auf Genexpressionsebene nachgewiesen werden.
Somit erlaubt das entwickelte Gerät, in vitro strukturelle Änderungen einer 3D-Nanotopographie zu simulieren und deren zellbiologische Effekte zu analysieren. Dies bietet für die Zukunft völlig neue Möglichkeiten, das Zellverhalten auf nanoskaligen 3D-Strukturen unter biomechanischen Einflüssen zu testen.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR18-1108
doi: 10.3205/14dkou526, urn:nbn:de:0183-14dkou5268
Published: October 13, 2014
© 2014 Maheswaran et al.
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/deed.en). You are free: to Share – to copy, distribute and transmit the work, provided the original author and source are credited.
by R-Dorotka | Apr 8, 2019 | Chirurgische Orthopädie, Konservative Orthopädie
BMP-2 Release aus mikroporösen beta-TCP Scaffolds mit Alginat als Carrier
Kißling S, Seidenstuecker M, Mayr HO, Südkamp NP, Bernstein A
Fragestellung: Bone Morphogenetic Protein-2 (BMP-2) führt zu gesteigerter Knochenneubildung. Die osteoinduktive Potenz von BMP-2 ist höher, wenn es in einen Träger eingebaut ist. Beta Tricalciumphosphat (beta-TCP) hat sich als geeignetes Material hinsichtlich Bioabbaubarkeit und mechanischer Stabilität erwiesen. Es ist bisher nicht gelungen, eine kontrollierte Freisetzungskinetik von BMP aus TCP-Scaffolds zu erzielen.
Das Ziel dieser Forschungsarbeit ist, eine definierte Freisetzung von BMP-2 über einen längeren Zeitraum durch Koppelung an ein Hydrogel zu erreichen und somit die Entwicklung eines osteoinduktiven, mechanisch stabilen Scaffolds.
Methodik: Als Modellsubstanz für BMP-2 wurde zunächst FITC-markiertes Protein A (2 mg/ml) verwendet. Für die Beladung der beta-TCP Zylinder (n=8; 40% Porosität, 5 μm Porendurchmesser, interkonnektierend, 7mm x 6 mm) wurden drei verschiedene Hydrogele verwendet und die Freisetzung miteinander verglichen: Gelatine, homogenes Alginatgel und inhomogen ausgehärtetes Alginat. Nach definierten Zeitpunkten (1, 2, 3, 6, 9, 14, 28 Tage) wurde freigesetzte Menge FITC-Protein A bestimmt. Anschließend wurde der Versuch mit dem inhomogen verfestigten Alginat und BMP-2 wiederholt. Weiter wurden beta-TCP-Scaffolds mit der Kombination BMP-2 (0,05 mg/ml) und Alginat (5% w/v) beladen und mit Osteoblast-like-cells (MG63) in Kontakt gebracht. Nach 24h, 48h und 96h wurde ein Live-Dead-Assay zur Beurteilung der Zellvitalität und der WST-1-Test zur Analyse der Viabilität durchgeführt.
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Die Abgabe des FITC-Protein A erfolgte sowohl aus der Gelatine, als auch dem homogenen Alginat sehr schnell. So waren bereits nach 24h 80,9% aus der Gelatine und 76,1% aus dem homogenen Alginat freigesetzt.
Das Release aus dem inhomogenen Alginat betrug nach 24h lediglich 36% der Gesamtmenge. Das BMP-2-Release betrug am Tag 14 des Versuchs 257,33 ± 73,19 ng/ml (~11,1%) sowie an Tag 28 des Release-Versuchs 57,56 ± 18,78 ng/ml (~1,82%).
Nach dem Freisetzungsversuch wurden die Scaffolds aufgebrochen und mikroskopiert. Dabei zeigten sich nach 28 Tagen noch deutliche Überreste des FITC-Protein A.
Mit dem Live-Dead-Assay konnte nachgewiesen werden, dass die freigesetzte Menge BMP-2 nicht toxisch ist. Die Zellen wuchsen in das Alginat des beladenen Knochenersatzdübels hinein.
Der WST-1-Test zeigt einen signifikanten Unterschied der Zellviabilität bei Inkubation mit einem BMP-2 und Alginat beladenen Scaffold im Vergleich zu einem lediglich mit Alginat beladenen Scaffold. Dies belegt eine deutliche Proliferationssteigerung.Aufgrund der höheren physikalischen Löslichkeit ist bei dem homogenen Alginatgel und der Gelatine ein deutlicher Burstrelease zu verzeichnen. Das Release aus dem festeren inhomogenen Alginat ist deutlich konstanter.
Osteoblast-like-cells zeigten in Kombination mit den BMP-2 beladenen beta-TCP-Scaffolds eine signifikant erhöhte Proliferation, sowie gute Vitalität.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR18-1140
doi: 10.3205/14dkou527, urn:nbn:de:0183-14dkou5276
Published: October 13, 2014
© 2014 Kißling et al.
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/deed.en). You are free: to Share – to copy, distribute and transmit the work, provided the original author and source are credited.
by R-Dorotka | Apr 8, 2019 | Chirurgische Orthopädie, Konservative Orthopädie
Biomechanische Stimulation von Osteoblasten und mesenchymalen Stammzellen auf 3D-Nanostrukturen
Maheswaran V, Özdemir B, Plettl A, Brenner R, Fiedler J
Fragestellung: Der Einfluss nanoskaliger Strukturen auf die Osseointegration von Biomaterialien nimmt bei der Implantatentwicklung eine zentrale Rolle ein. In vorherigen Arbeiten konnten wir die Effekte verschiedener, starrer Nanostrukturen auf humane mesenchymale Stammzellen und Osteoblasten zeigen. Aufbauend auf diese Arbeiten haben wir die Untersuchung der Zell-Biomaterial-Wechselwirkung erweitert, indem ein neuartiges System zur biomechanischen Stimulation der Zellen auf SiO2 basierten dreidimensionalen Trägermaterialien etabliert wurde.
Methodik: Humane Osteoblasten (Ob) und mesenchymale Stammzellen (MSC) wurden aus Restgewebe von Total-Endoprothese-Operationen isoliert. Eine biomechanische Stimulation der Zellen auf 3D-Nanostrukturen erfolgte durch eine neuartige, selbstentwickelte Apparatur.
Mit dieser neuen Methode wurden biegeelastische nanolithotopographisch hergestellte dreidimensionale SiO2-Oberflächen (Abbildung 1 A [Abb. 1]) mit einer Höhe von 100 nm, einem Durchmesser von 10-30 nm und einem Säulenabstand von 100 nm mit Ob und MSC besiedelt und je für 30 min in 24 h zyklisch (Frequenz: 1 Hz) gebeugt. (Abbildung 1 B und C [Abb. 1]) Analysiert wurden die Genexpression osteogener und apoptotischer Markergene mittels quantitativer RT-PCR, sowie die Auswirkung der biomechanischen Stimulation auf das Zytoskelett über immunhistologische Färbungen von Aktin, Vinculin und Vimentin. Eine Statistische Auswertung erfolgte mittels Varianzanalyse (ANOVA).
Ergebnisse und Schlussfolgerung: Die entwickelte Apparatur erlaubte die sterile Kultivierung der Zellen über den gesamten Testzeitraum von 48h. Im Vergleich zu den bisher untersuchten nanostrukturierten Substraten gab es bezüglich der Zelladhäsion keine Unterschiede, d.h. alle Zellen adhärierten auch auf den eingesetzten dreidimensionalen SiO2-Membranen. Nach der biomechanischen Stimulation zeigten die Zellen weiterhin Adhärenz auf dem Trägermaterial, wobei Zell-morphologische Unterschiede im Vergleich zu nicht stimulierten Oberflächen sichtbar wurden. Daraus ist zu Folgern, dass die geringen, im 1 nm Bereich liegenden Änderungen der Säulen-Abstände zur Modulation der Zell-Antwort führten. Dieser Einfluss konnte auch auf Genexpressionsebene nachgewiesen werden.
Somit erlaubt das entwickelte Gerät, in vitro strukturelle Änderungen einer 3D-Nanotopographie zu simulieren und deren zellbiologische Effekte zu analysieren. Dies bietet für die Zukunft völlig neue Möglichkeiten, das Zellverhalten auf nanoskaligen 3D-Strukturen unter biomechanischen Einflüssen zu testen.
Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2014). Berlin, 28.-31.10.2014. Düsseldorf: German Medical Science GMS Publishing House; 2014. DocGR18-1108
doi: 10.3205/14dkou526, urn:nbn:de:0183-14dkou5268
Published: October 13, 2014
© 2014 Maheswaran et al.
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/deed.en). You are free: to Share – to copy, distribute and transmit the work, provided the original author and source are credited.
